UJI KUANTITATIF DNA BAKTERI
Rr. Bhintarti Suryo Hastari, M. Biomed1)
Maulana Malik Assayiddin2), Puri Dwi Nurmaulida 2),
Fuzi Muchlissoh3),
Muhammad Faiz3), Mutia Afifah3), Ratna Lestyana D.3)
, Rizky Hastuti P.3
1)Dosen
Praktikum Biologi Molekular; 2)Asisten Dosen Praktikum Biologi
Molekular; 3)Praktikan
Program Studi
Biologi Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta
Abstrak
Uji kuantitatif
DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat
dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan
DNA plasmidnya dalam larutan dengan uji kualitatif. Metode ini menggunakan
bantuan alat spektrofotometer. Sampel ekstraksi dibagi ke dalam enam kelompok.
Kelompok 1-3 adalah sampel Bacillus
cereus (Bc 1,2,dan 3) dan kelompok 4-6 adalah Acetobacter xyulinum (Ax 4,5, dan 6). Nilai kemurnian DNA berada
pada kisaran 0,304-0,771 sedangkan nilai konsentrasi berada pada kisaran 25-135
µg/ml. Secara keseluruhan sampel, nilai
kemurnian DNA berada di bawah 1,8, sehingga dapat dikatakan bahwa sampel DNA
kurang murni dan kurang bersih.
Abstract
Quantitative DNA test is an analysis to determine the content or the amount of DNA present in a substance or substances which components have previously been shown the presence of DNA plasmids in the solution with the qualitative test. This method uses the aid of a spectrophotometer. Sample extraction was divided into six groups. 1-3 is a sample group of Bacillus cereus (Bc 1,2, and 3) and the group 4-6 is Acetobacter xyulinum (AX 4.5, and 6). DNA purity value in the range of 0.304 to 0.771, while the concentration in the range of 25-135 pg / ml. Overall samples, DNA purity values were under 1.8, so it can be said that the DNA sample is less pure and less clean.
Key words: Bacteria, DNA,
purification
PENDAHULUAN
Isolasi DNA merupakan
tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA dapat ditemukan baik
pada kromosom inti maupun organel, yaitu mitokondria dan kloroplas. Isolasi DNA
dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain, yaitu preparasi ekstrak
sel, pemurnian DNA dari ekstraksi sel dan presipitasi DNA. Tahapan untuk
mengekstrak DNA, diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan
dinding sel dan membran inti, yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari
berbagai komponen sel lain. Pada saat melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak
rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang (Fatchiyah et al.
2012).
Meskipun isolasi DNA
dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis dapat
memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan
polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA
(Zubaidah, 2004).
Uji kuantitatif DNA
adalah analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat dalam
suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA
plasmidnya dalam larutan dengan uji kualitatif. DNA yang mengandung basa-basa
purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap
cahaya UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein atau fenol dapat menyerap
cahaya pada 280 nm. Adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini maka kemurnian
DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai
absorbansi 280, dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah et
al. 2011).
Menurut Muhammad, S. A.,
dan Praseno (1991), rasio yang kurang dari 1,8 menunjukan bahwa preparasi DNA
telah terkontaminasi baik oleh fenol maupun protein. Sedangkan rasio yang
dengan nilai di atas dua (> 2) berarti bahwa preparasi DNA telah
terkontaminasi oleh RNA. Oleh karena itu, praktikum ini bertujuan untuk
mengetahui kemurnian dari suatu DNA dalam larutan sampel melalui teknik uji
kuantitatif DNA dengan alat spektrofotometer UV-Vis
MATERIAL DAN METODE
Praktikum ini dilakukan
pada hari Senin, 28 November 2016 pada pukul 08.00–10.00 WIB yang bertempat di
PLT (Pusat Laboratorium Terpadu) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Sampel
ekstraksi dibagi ke dalam enam kelompok. Kelompok 1-3 adalah sampel Bacillus
cereus (Bc 1,2,dan 3) dan kelompok 4-6 adalah Acetobacter xyulinum (Ax
4,5, dan 6).
Alat yang digunakan
pada praktikum ini adalah spektrofotometer, mikropipet, tip, vortex, mikrotube,
sentrifuge, dan kuvet. Sedangkan bahan yang digunakan adalah sampel ekstraksi DNA
bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum dan akuabides.
Cara kerjanya, yakni pertama, hasil ekstraksi dithowing terlebih
dahulu untuk memastikan sampel sudah tidak terlalu dingin,
kemudian divortex selama 10 detik. Lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12.000
rpm selama 3 menit. Selanjutnya, sampel yang akan digunakan konsentrasinya
diencerkan hingga 100x (10 µl sampel DNA dan 990 µl akuabides), sampel yang
telah diecerkan lalu dimasukkan pada mikrotube baru dan divortex selama 10
detik. Disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit.
Setelah itu dipindahkan ke dalam kuvet dan diukur nilai absorbansinya pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm di spektrofotometer UV-Vis.
HASIL
Hasil yang didapat
berupa kemurnian DNA dan konsentrasi DNA. Hasil uji kuantitatif terhadap DNA
yang diisolasi dapat dilihat pada tabel 1. di bawah ini.
Tabel 1.
Hasil Uji Kuantitatif DNA dengan Sprektofotometer
Kelompok
|
Kode Sampel
|
Nilai Absorbansi (nm)
|
Kemurnian DNA
|
Konsentrasi DNA
(µg/ml)
|
|
l
= 260
|
l=
280
|
||||
1
|
Bc1
|
0.017
|
0.029
|
0.586
|
85
|
2
|
Bc2
|
0.005
|
0.012
|
0.417
|
25
|
3
|
Bc3
|
0.022
|
0.038
|
0.579
|
110
|
4
|
Ax4
|
0.007
|
0.023
|
0.304
|
35
|
5
|
Ax5
|
0.027
|
0.035
|
0.771
|
135
|
6
|
Ax6
|
0.019
|
0.027
|
0.704
|
95
|
Kode Bc menunjukkan
sampel bakteri Bacillus cereus dan
sampel Ax menunjukkan sampel Acetobacter
xylinum. Konsentrasi dan nilai kemurnian DNA tertinggi pada masing-masing
kelompok sampel (Bc dan Ax), yakni terdapat pada sampel kelompok 3 dan pada sampel kelompok 5.
Nilai yang dihasilkan pada sampel kelompok 3 sebesar 0,579 dan 110 µg/ml dan pada
sampel kelompok 5 sebesar 0,771 dan 135 µg/ml. Nilai kemurnian dan konsentrasi DNA pada sampel Bc dan Ax memiliki nilai yang bervariasi. Nilai
kemurnian berada pada kisaran 0,304-0,771 sedangkan nilai konsentrasi berada
pada kisaran 25-135 µg/ml. Secara
keseluruhan sampel, nilai kemurnian DNA berada di bawah 1,8. Nilai kemurnian
DNA berbanding lurus dengan nilai konsentrasi DNA nya. Semakin tinggi nilai
kemurnian DNA nya maka semakin tinggi pula nilai konsentrasi DNA nya.
PEMBAHASAN
Praktikum uji
kuantitatif DNA digunakan sampel isolasi bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter
xylinum. Uji ini menggunakan bantuan alat spektrofotometer. Uji kuantitatif
merupakan metode analisis untuk mengukur
konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi
berkas sinar atau cahaya. Spektofotometer menghasilkan sinar dari spektrum
dengan panjang gelombang tertentu (Fatchiyah, dkk. 2012).
Uji
kuantitatif DNA merupakan analisis untuk mementukan kandungan atau jumlah DNA
yang terdapat di dalam suatu sampel. DNA dan RNA menyerap pada panjang gelombang
maksimal 260 nm, sementara protein menyerap kuat pada gelombang 180 nm. Selain
itu, asam nukleat dapat menyerap secara signifikan pada panjang gelombang 280
nm dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260 nm. Sehingga untuk
mengukur dengan akurat konsentrasi DNA, RNA, dan protein dalam suatu campuran
yang kompleks bukan hal yang mudah. Pengukuran absorbansi pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm dapat memberikan validasi kemurnian sampel asam
nukleat dengan nilai 1,8 untuk DNA dan 2,0 untuk RNA yang mengindikasikan
sampel murni. Nilai yang rendah akan menunjukkan adanya kontaminan lain atau
terdapatnya protein (Teare, 2009).
Absorbansi
spektrofotometri adalah teknik yang cepat dan akurat untuk menentukan
konsentrasi sampel DNA murni. Hal ini menjadi kurang akurat ketika sampel DNA
mengandung protein, RNA, oligonukleotida primer atau nukleotida. RNA, primer
dan nukleotida menyerap kuat pada 260 nm dan tidak bisa dibedakan dari DNA.
Kontaminan seperti protein dapat menyebabkan kelebihan isi DNA dalam sampel
campuran. Masalah ini dapat diatasi dengan menggunakan metode alternatif untuk
mengukur DNA saja dalam sampel dan dapat diatasi juga dengan menambahkan suatu
senyawa berfluoresensi, yaitu DNA quant 200. Metode pemurnian sampel
(DNA) juga dapat dilakukan secara kimiawi,
yaitu dengan cara merusak sel kemudian diberi buffer lisis yang berisi
senyawa kimia yang dapat merusak integritas barrier dinding sel, senyawa kimia
yang dipakai diantaranya lisosom, EDTA (etilen diamin, tetra asetat), Tris-CL
atau deterjen, SDS (sodium dosecycle sulphate).
Berdasarkan
hasil yang didapat dari analisis kuantitatif DNA bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter
xylinum dengan menggunakan alat spektrofotometer, nilai kemurnian DNA dari
kedua sampel bakteri tersebut tidak ada yang mendekati nilai 1,8 sehingga DNA
dapat dikatakan memiliki tingkat kemurnian DNA yang rendah. Hal ini menunjukkan
bahwa masih banyak terdapat pengotor fenol dan protein. DNA yang murni memiliki
rasio 1,8. Apabila nilai rasio lebih dari 1,8 menunjukkan adanya RNA, hal ini
karena RNA juga diserap pada panjang gelombang yang sama yaitu λ260 - λ280 nm.
Berdasarkan
nilai absorbansi pada l=260 nm dari kedua DNA bakteri tersebut,
dapat dikatakan DNA kromosomal kedua bakteri yang diisolasi memiliki tingkat
kemurnian yang rendah dan kurang bersih. Menurut Restu, dkk (2012), secara
teoritis sampel DNA yang dianggap cukup murni memiliki perbandingan A260/A280 =
1,8-2,0. Tingkat kemurnian DNA yang rendah dapat dimungkinkan terdapatnya
kontaminasi fenol. Rasio OD 260/OD 280 < 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi
fenol atau protein hasil ekstraksi (Devereu dan Wilkinson, 2004). Umumnya pemurnian DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol, klorofom,
dan isoamil alcohol yang berfungsi untuk menghilangkan senyawa yang
dapat mengkontaminasi DNA (Mulyani, 2011). Pemurnian DNA dengan penambahan
fenol dan kloroform berguna untuk mengendapkan protein dengan melalui proses sentrifugasi
dan dihancurkan secara enzimatis dengan protease (Thermo Scientific, 2009).
DNA
yang telah dibersihkan dari protein menggunakan fenol, masih bercampur dengan
RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA, karena
ekstraksel mengandung protein dan RNA disamping DNA dalam jumlah yang besar
(Thermo Scientific, 2009). Praktikum uji kuantitatif DNA tidak menggunakan
penambahan enzim RNAse sehingga kemungkinan masih banyaknya RNA yang terkandung
di dalam sampel, sehingga menyebabkan nilai kemurnian kedua DNA bakteri
tersebut kurang dari 1,8.
KESIMPULAN
Berdasarkan
hasil uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometer UV-Vis maka dapat disimpulkan
bahwa tingkat kemurnian DNA dari keseluruhan sampel adalah kurang bersih dan
kurang murni karena menunjukkan nilai di bawah 1,8.
SARAN
DNA
yang telah diekstraksi perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel
yang lain agar DNA yang diperoleh memiliki nilai kemurnian yang tinggi. Selain
itu, perlu dilakukannya pemurnian kembali dan penambahan proteinase karena
nilai kemurnian DNA yang didapat masih menujukan angka kurang dari 1,8.
DAFTAR PUSTAKA
Devereux, R. & S.S. Wilkinson. 2004.
Amplification of Ribosomal RNA Sequance. Kluwer Academic Publiser. Netherlands
Fatchiyah, et al. 2012. Buku
Praktikum Teknik Analisa Biologi Molekuler. Laboratorium Biologi Molekuler dan
Seluler Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Brawijaya. Malang.
Muhammad, S. A., dan Praseno. 1991. Pengantar
Kloning Gen. Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta. Hal 31-33.
Mulyani , Yuniar. Purwanto, Agus, dan .
Nurruhwati, Isni. 20011. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk
Deteksi Koi Herpes Virus (KHV) pada Ikan Mas (Cyprinus carpio L.). Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjajaran Jatinangor. Bandung.
Restu, Muh., Mukrimin, dan Gusmiaty.
2012. Optimasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi Tanaman Suren (Toona sureni Merr.)
untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD). Jurnal Natur Indonesia 14(2) : 138-142.
Teare, J.M. et al. 2009.
Measurement of Nucleic Acid Concentration Using the DyNa QuantTM and the
GenequantTM. BioTechniques. 1997;22(6):1170-1171.
Thermo Sience. 2009. Thermo Scientific
Pierce Cell Lysis Technical Handbook : Featuring Cell Lysis Reagent and
Detergents, Ver. 2
Tidak ada komentar:
Posting Komentar