ISOLASI DNA KROMOSOMAL BAKTERI
drh. Rr. Bhintarti Suryo
Hastari, M. Biomed1) Maulana Malik Assayiddin2), Puri Dwi
Nurmaulida 2) Fuzi Muchlissoh3),
Muhammad Faiz 3), Mutia Afifah3) Ratna Lestyana Dewi3) ,
Rizky Hastuti Purwaningsih3)
1)Mahasiswa Program Studi Biologi Dosen
Praktikum Biologi Molekular Prodi Biologi
2) Asisten Dosen Praktikum Biologi
Molekular Prodi Biologi
3) Mahasiswa Program Studi Biologi
Program Studi Biologi
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta
Abstrak
Perkembangan
ilmu biologi molekuler yang semakin maju memicu adanya rasa penasaran untuk
mempelajari materi genetik (gen) penyusun dari suatu makhluk hidup. Tubuh
makhluk hidup tersusun dari beberapa organel, salah satunya ribosom. Tujuan praktikum
ini untuk
dapat mengisolasi DNA pengkode gen 16S rRNA dari bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum, mengamplifikasi
DNA tersebut dengan metode PCR, serta
dapat mengidentifikasi fragmen DNA tersebut dengan menggunakan elektroforesis
horisontal gel agarosa. Metode dalam praktikum ini yaitu preparasi sampel,
isolasi DNA, amplifikasi, dan elektroforesis horizontal gel agarosa. isolasi DNA bakteri 16S RNA menghasilkan 3 tabung
sampel ekstraksi dari bakteri Bacillus cereus dan 3 tabung sampel dari Acebacter
xylinum. Pada tahap amplifikasi dengan PCR, dihasilkan 12 tabung sampel dengan
2 macam formula yang dibedakan berdasarkan komposisi volume dari DNA template
serta komposisi primer. Pada tahapan elektroforesis dihasilkan 14 pita DNA
ladder dan 4 pita sampel yang terlihat sejajar dengan pita Marker.
Kata kunci: DNA, elektroforesis, isolasi, PCR
Abstract
The development of
molecular biology more advanced trigger their curiosity for the review study of
genetic material (genes) constituent of a living. Living body composed from
several organelles, praying only ribosomes. Singer laboratory objectives for
the review can be isolated DNA encoding 16S rRNA genes from bacteria Bacillus
cereus and Acetobacter xylinum, amplify the DNA by PCR method, as well as DNA
fragments can be identified using the with horizontal agarose gel
electrophoresis. Namely hearts methods practicum singer sample preparation, DNA
isolation, amplification, and agarose gel electrophoresis horizontal. DNA
isolation bacteria 16S rRNA extraction sample tubes produce 3 from the bacteria
Bacillus cereus and 3 sample tubes from Acebacter xylinum. On the PCR
amplification stage, produced 12 kinds of sample tubes with two the
differentiated formula based on the composition volume from DNA templates as
well as the primary composition. Based on stages produced 14 DNA
electrophoresis ladder and four tape samples in parallel with visible marker
tape.
Keywords: DNA,
electrophoresis, isolation, PCR
================================================================================
PENDAHULUAN
Perkembangan
ilmu biologi molekuler yang semakin maju memicu adanya rasa penasaran untuk
mempelajari materi genetik (gen) penyusun dari suatu makhluk hidup. Tubuh
makhluk hidup tersusun dari beberapa organel, salah satunya ribosom. Ribosom
tersusun atas molekul sub unit besar dan molekul sub unit kecil. Mikroorganisme
prokariotik seperti bakteri tersusun atas 50S dan 30S. Sub unit 50S berisi dua
rRNA (23S dan 5S) kompleks dengan 34 protein dan subunit 30S rRNA 16S
mengandung kompleks dengan 21 protein (Campbell, et al, 2008).
Deoxyribonucleic
acid (DNA) merupakan senyawa kimia paling
penting pada makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi
genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo, 2004).
Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk Genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun
non-fungsional dalam sel organisme. Bakteri termasuk organisme pokariotik yang
memiliki DNA berbentuk sirkular dan terletak di dalam sitoplasma (Jusuf, 2001).
Isolasi DNA merupakan langkah untuk mempelajari DNA. Isolasi DNA dilakukan
dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain, seperti protein, lemak, dan
karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi
DNA ada tiga, yakni penghancuran (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA dari
bahan padat, seperti selulosa dan
protein, serta pemurnian DNA (Fatchiyah, et al, 2011).
Tahap lanjutan
dari isolasi DNA adalah amplifikasi DNA dengan Polymerse Chain Reaction
(PCR). Hal tersebut bermanfaat dalam memperbanyak jumlah DNA agar dapat
dimanfaatkan lebih maksimal karena jumlahnya lebih banyak. Hasil dari PCR dapat
dilihat menggunakan elektroforesis gel untuk mengetahui visualisasi dari
tahapan-tahapan di atas dan mengetahui
berat molekul dari pita DNA target. Oleh karena itu, praktikum ini bertujuan
untuk dapat mengisolasi DNA pengkode gen 16S rRNA dari bakteri Bacillus
cereus dan Acetobacter xylinum, mengamplifikasi DNA tersebut dengan metode PCR, serta dapat
mengidentifikasi fragmen DNA tersebut dengan menggunakan elektroforesis
horisontal gel agarosa.
METODE
a.
Lokasi
dan Waktu
Praktikum ini dilakukan pada
tanggal 7, 14, dan 21 November 2016 di
Laboratorium Fisiologi dan Laboratorium Mikrobiologi, Pusat Laboratorium
Terpadu (PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
b.
Bahan
dan Alat
Bahan yang digunakan dalam
praktikum ini adalah biakan koloni bakteri cair Bacillus cereus dan Asetobakter
silinum, H2O, instagene matriks,
gen Rrna 16S, primer 27 F dan
1492 R, dream taq green 2x master mix + dye, nuclease free water, peq green,
buffer TAE 1x, marker, loading dye, dan gel agarose 1%.
Alat yang digunakan dalam praktikum
ini adalah mikro tube, sentrifuge, mikropipet, water bath, vortex,
thermocycler, tangki elektroforesis, transluminator UV, Erlenmeyer, sisir,
microwave, dan kamera.
c.
Langkah
Kerja
Preparasi DNA
Bakteri dengan Instagene Matriks
Biakan koloni cair bakteri Bacillus cereus dan Asetobakter silinum diresuspensi dalam 1 ml di dalam H2O,
selanjutnya di sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Kemudian
seupernatan dibuang dengan menggunakan mikropipet. Pellet ditambahkan 100µl
instagene matriks strirrer moderated speed. Selanjutnya diinkubasi di dalam
water bath dengan suhu 560C selama 30 menit, kemudian di vortex
selama 10 detik, dan diinkubasi kembali dengan suhu 1000C selama 8
menit. Kemudian di vortex selama 10 detik, di sentrifuge dengan kecepatan
12.000 rpm selama 3 menit. Kemudian super natan dipindahkan ke dalam tabung
baru dan disimpan dalam suhu 40C.
PCR Gen 16S rRNA
Isolat bakteri Bacillus cereus dan Asetobakter
silinum yang ada di microtube, masing-masing dibagi menjadi 2 tipe yaitu a
untuk Asetobakter silinum dan b untuk
Bacillus cereus. Tipe a di masukkan
formula 2x dream taq green RM+dye sebanyak 12,5 µl menggunakan micropipette,
kemudian ditambahkan DNA template sebanyak 10 µl, 10 µM primer 27F sebanyak
1,25 µl, 10 µM primer 1492 R sebanyak 1,25 µl setelah itu, sampel dihomogenkan menggunakan
vortex dalam waktu 5 detik. Tipe b dimasukkan formula 2x dream taq green RM+dye
sebanyak 12,5 µl menggunakan micropipette, kemudian ditambahkan DNA template
sebanyak 1 µl, 10 µM primer 27F sebanyak 0,5 µl, 10 µM primer 1492 R sebanayak
0,5 µl, dan nuclease free water sebanyak 10,5 µl, setelah itu dihomogenkan menggunakan vortex dalam waktu 5 detik.
Selanjutnya, PCR di set dengan suhu pre-denaturasi 950 C selama 5
menit, denaturasi 950C selama30 detik, anneling 510 C
selama 30 detik, ektension 720 C selama 2 menit, final ekstension 72
0C selama 10 menit, dan stop pada suhu 40 C. Microtube
disusun di dalam Thermocycler pada bagian tengah, dan ditekan tombol start dan
didiamkan hingga proses selesai.
Elektroforesis
Gel Agarose
Pembuatan gel dengan memasukkan gel
agarose 1% sebanyak 0,25 gram dan 25 ml buffer TAE 1x ke dalam Erlenmeyer, selanjutnya
dimasukkan ke dalam microwave selama 30 menit, dimasukkan peq green sebanyak 1
µl pada saat gel agarose bersuhu 500C yang kemudian dihomogenkan.
Selanjutnya gel agarose yang sudah homogen dimasukkan ke dalam cetakan dengan
posisi yang seimbang. Sebelum meletakkan gel agarose di dalam cetakan,
diletakkan sisir terlebih dahulu pada urutan 8 dan 15, setelah itu baru gel
agarose dituang ke dalamnya. Gel agarose akan berubah menjadi warna keabu-abuan
jika sudah megeras. Selanjutnya gel agarose dimasukkan pada chamber. Produk PCR
b dimasukkan pada sisir B dengan menggunakan mikropipet. Pemasukkan sampel
dilakukan dari sisi kiri menuju sisi kanan. Formula marker terdiri dari 1 µl
marker ditambah 1 µl loading dye, dan 4 µl air, sedangkan formulasi ekstraksi
sampel sebanyak 5 µl ditambah 1 µl loading dye. Sampel dimasukkan pada cetakan
gel agarose sesuai formasi yang telah ditentukan. Running elektroforesis dengan
panjang gelombang 80v, tegangan 400mA selama 45 menit.
Transluminator
UV
Hasil running pada elektroforesis
divisualisasikan menggunakan sinar UV pada transluminator. Gel agarose
diletakkan di atas transluminator uv, selanjutnya ditutup dengan penutup anti
sinar uv. Digunakan kaca mata pelindung anti sinar uv, selanjutnya dinyalakan
saklar lampu uv dan diamati pita DNA yang tampak dan didokumentasikan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA merupakan tahap pertama
dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA dapat ditemukan di kromosom inti
maupun di organel (Fatchiyah, 2011). Prinsip utama dalam isolasi DNA yaitu
sentrifugasi dan presipitasi.
Praktikum ini menggunakan bakteri Bacillus cereus dan Asetobakter silinum yang kemudian diisolasi DNA-nya. Isolasi DNA
bakteri digunakan dream taq green 2x master mix atau yang disebut sebagai
instagene matriks, merupakan sebuah kit yang sudah diproduksi secara
konvensional yang berfungsi untuk mempercepat proses isolasi DNA. Kandungan
yang terdapat di dalamnya yaitu air dan polystyrene-divinylbenzene
iminodiacetate (Bio-Rad, 2015).
Isolasi DNA memiliki prinsip untuk
memisahkan DNA kromosom atau atau DNA genom dari komponen sel yang lain.
Setelah kultur disentrifugasi didapat endapan putih yaitu berupa supernatant.
Prinsip utama dari sentrifugasi yaitu memisahkan substansi berdasarkan berat
jenis molekul, sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar.
Prinsip dari presipitasi yaitu pengendapan DNA agar terpisah dari zat lain yang
terdapat di sel (Kimball, 2005).
Isolasi DNA bakteri menggunakan
metode boiling dengan melakukan pemanasan suhu tinggi selama beberapa menit
yang menyebabkan peningkatan permeabilitas dinding sel yang berakibat masuknya
cairan dan materi lain di sekitar sel dan keluarnya materi dari dalam sel. Suhu
tinggi berfungsi untuk inaktifasi enzim, terutama DNA-ase yang dapat merusak
DNA. Suhu yang digunakan dalam pemanasan tergantung pada sampel yang digunakan.
Ekstraksi DNA dengan metode boiling mudah untuk dilakukan karena hanya
membutuhkan waktu yang tidak terlalu lama, namun kualitas yang dihasilkan
relative lebih rendah dibandingkan dengan metode lain (Sunarno et al, 2014).
Polymerase chain
reaction (PCR) merupakan salah satu teknik yang paling penting dalam
biologi molekuler. Teknik tersebut bertujuan untuk memperbanyak DNA secara in
vitro dalam suatu reaksi termal. Metode PCR telah banyak berperan dalam
pengembangan bidang biologi molekuler khususnya genetika. Beberapa aplikasi
metode PCR diantaranya human genome
project, diagnosis penyakit genetik, analisis
filogenetik dan lain-lain.
Teknik PCR merupakan suatu metode enzimatik untuk memperbanyak
(amplifikasi) DNA secara in vitro (ekstraselular) (MSU 2008:1). Prinsip kerja
PCR (Polymerase Chain Reaction) yaitu
menggunakan reaction mixture serta memanfaatkan enzim dari DNA polymerase yang bersifat termostabil
dan fragmen DNA yang pendek disebut primer. Primer berfungsi untuk mensintesis
secara langsung sekuens DNA target spesifik dari DNA template. Reaksi sintesis
tersebut terus berulang sehingga membentuk suatu siklus. Produk dari siklus
sintesis sebelumnya dapat berfungsi sebagai template atau cetakan bagi siklus
selanjutnya. Hasilnya ialah amplifikasi eksponensial dari sekuens DNA target.
Siklus yang berulang tersebut dapat berlangsung karena penggunaan Taq
polymerase. Taq polymerase ialah sebuah enzim polymerase bersifat termostabil
yang diisolasi dari bakteri termofilik yaitu Thermus aquaticus (MSU 2008:1).
Komponen – komponen dalam reaction
mixture PCR yaitu H2O steril, fungsinya sebagai pelarut
campuran. Bufer berfungsi untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan
menstabilkan enzim DNA polymerase. Bufer biasanya terdiri atas bahan-bahan
kimia. Komponen lainnya yaitu dNTP (deoxynucleoside
triphosphate) sebagai pembentuk basa komplementer dan penyusun DNA, terdiri
atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP
(MSU 2008: 2). Primer berfungsi untuk menginisiasi sintesis DNA pada sekuens
target yang spesifik dan membatasi reaksi polimerisasi DNA. Primer terdiri dari
dua macam, yaitu primer forward dan
primer reverse. Primer forward untuk menginisiasi sintesis
untai DNA dari ujung 5’ ke ujung 3’, sedangkan primer reverse menginisiasi sintesis DNA dari ujung 3’ ke ujung 5’. Kation
divalen terdiri dari ion logam bivalen (umumnya Mg2+) dan ion logam
monovalen (K+), berfungsi sebagai kofaktor bagi enzim DNA
polymerase. Tanpa ion-ion tersebut enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja
(Science biotech.net , 2011) DNA template adalah DNA yang memiliki sekuens
target untuk penempelan primer, berfungsi sebagai cetakan DNA yang akan diamplifikasi
(Agustian, 2008). Komponen yang terakhir yaitu enzim DNA polymerase berfungsi
untuk membaca kode DNA serta menghubungkan pasangan nukleotida dalam
menghasilkan salinan DNA (The university of Utah 2008).
Primer atau disebut juga dengan oglinukleotida (sepasang DNA
utas tunggal pendek) merupakan suatu fragmen yang terdiri atas 20-30 basa dan
basa-basa tersebut akan berkomplemen secara spesifik dengan DNA cetakan. Primer
dirancang dengan memiliki sekuens yang komplemen dengan DNA template sehingga
dapat mengapit daerah tertentu yang diinginkan. Syarat primer yang baik antara
lain memiliki panjang basa oglinukleotida antara 18-24 basa, mempunyai urutan
basa-basa spesifik untuk melekat pada DNA cetakan, tidak terdapat basa-basa
yang berkomplemen pada ujung 3’ yang menyebabkan terjadinya dimer, komposisi
basa guanin (G) dan sitosin (C) adalah 50% dari seluruh basa, dan dua primer
yang dipasangkan memiliki suhu melting yang tidak berbeda jauh (Agustian, 2008).
Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap yaitu denaturasi, annealing,
dan polimerisasi. Denaturasi berlangsung pada suhu 94o C selama 30
detik. Pada tahap denaturasi, reaksi enzimatik berhenti dan ikatan
hidrogen terputus sehingga DNA untai ganda berpisah menjadi DNA untai tunggal.
Annealing berlangsung pada suhu 55o C selama 3 detik. Pada
tahap tersebut primer akan menempel pada DNA template di tempat yang
berkomplemen dengan sekuens primer. Tahap terakhir yaitu polimerisasi
berlangsung selama 30 detik pada suhu 72o C merupakan proses
pemanjangan primer menggunakan untai tunggal DNA sebagai cetakannya. DNA
polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai dengan pasangannya (Agustian, 2008).
Cara mendesain suhu dan waktu pada setiap tahap siklus PCR
ialah dengan mengatur CYCL program pada mesin thermal cycler. Pada menu utama, ditekan tombol option dan dipilih create lalu enter. Kemudian ditekan tombol option dan dipilih CYCL
lalu tekan enter. Tentukan angka setpoints
satu sampai tiga. Dimasukkan suhu dan waktu sesuai dengan yang diinginkan.
Ditekan enter untuk mengkonfirmasi nilai yang telah dimasukkan. Selanjutnya,
ditentukan jumlah siklus dengan menekan enter a new value. Mesin thermal
cycler akan running sesuai dengan kondisi yang telah diatur. Jumlah siklus
PCR ditentukan oleh rumus 2n dengan n adalah banyaknya jumlah siklus (Labequip,
2006).
Suhu penempelan atau annealing ditentukan berdasarkan primer yang
digunakan serta dipengaruhi oleh komposisi dan panjang primer. Suhu penempelan
yang baik berkisar 5o C dibawah suhu leleh atau melting temperature
(Tm). Suhu leleh (Tm) dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
Tm = 4(G+C) + 2(A+T) oC
Keterangan :
Tm = melting temperature
(G+C) = jumlah guanin dan sitosin pada oglinukleotida
(A+T) = jumlah adenin dan timin pada oglinukleotida (Abinawanto dkk. 2011: 47).
Tm = 4(G+C) + 2(A+T) oC
Keterangan :
Tm = melting temperature
(G+C) = jumlah guanin dan sitosin pada oglinukleotida
(A+T) = jumlah adenin dan timin pada oglinukleotida (Abinawanto dkk. 2011: 47).
Mesin thermal cycler
merupakan mesin yang dapat diprogram untuk menaikkan dan menurunkan suhu
sesuai dengan urutan waktu dan suhu yang diinginkan, dalam hal ini mengatur
siklus annealing, elongasi, dan denaturasi pada saat amplifikasi DNA
berlangsung (UNAIR 2011: 1). Kontrol positif diperlukan untuk memudahkan
pemecahan masalah apabila terjadi hal yang tidak diinginkan. Selain itu,
kontrol positif juga diperlukan untuk memverifikasi hasil amplifikasi negatif
dan reaksi kontrol positif harus mengandung komponen yang sama dengan sampel.
Kontrol negatif dibutuhkan untuk menghindari kesalahan positif semu seperti
terjadinya kontaminasi atau reaksi amplifikasi non spesifik (Handoyo & Ari
2001: 28).
Amplifikasi DNA dengan metode PCR memiliki kelebihan dan
kekurangan jika dibandingkan dengan teknik lain. Adapun kelebihan metode PCR
adalah dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan
kali hanya dalam beberapa jam. Selain itu reaksi amplifikasi sangat spesifik
dan akurat serta mudah dilakukan secara otomatis. Kekurangan metode PCR adalah
dibutuhkan banyak biaya untuk memperbanyak DNA, campuran yang digunakan rentan
terhadap kontaminasi, dan metode PCR tidak bisa mengekspresikan mutasi genetik
(Handoyo & Ari 2001: 20).
Elektroforesis adalah suatu teknik
pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan
listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang
dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang
ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).
Prinsip kerjanya adalah jika
molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya
gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang
berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub
negatif ke kutub positif (Elektroforesis)
melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005).
Terdapat
dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis
horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Adapun elektroforesis yang
digunakan adalah elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang
diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini
difungsikan untuk analisais DNA.
Kelebihan
metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses berlangsung,
sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil percobaan dapat
disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga
dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di
lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan, metode ini juga
memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan
campuran sampel ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil
(Boffey, 1984).
Praktikum
elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 1%. Proses
pembuatan gel agarose 1% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarose
dengan larutan buffer TAE 1x yang kemudian dipanaskan di dalam microwave selama
30 detik, selanjutnya diberikan 1ul pewarna peq green (pada suhu 500C)
dan kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya
dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,25 gr
dan larutan running buffer TAE 1x (Trisasetat-EDTA)
sebanyak 25 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA
berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras,
gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running
buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah
pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner dkk, 1991).
Tahap
selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi
membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses
elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru
(Magdeldin, 2012).
Selanjutnya
dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 6µl dan
juga larutan marker sebanyak 6µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel.
Sedangkan untuk marker dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang
ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan
secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak melebihi batas
ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4)
sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).
Marker
adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker
berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi.
Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai
penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi.
Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik
sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah
lambda HindIII. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan
kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993; Martin, 1996).
Praktikum
dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus
listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 80
V dan dengan arus sebesar 400 mA selama 45 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat
dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan
bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin,
2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah
mengalami perubahan warna. Dokumentasi dilakukan dengan transluminator UV
(Davis dkk, 1994).
Berdasarkan
pada proses elektoforesis, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan
dari molekul DNA, yaitu:
1. Ukuran
Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat
bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak
dibandingkan molekul berukuran besar.
2. Konsentrasi
gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel
yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA.
Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran
kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan
ukuran yang lebih besar.
3. Bentuk
molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan
lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.
4. Densitas
muatan
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul.
Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan
molekul dengan densitas muatan yang rendah.
5. Pori-pori
gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin
lambat pergerakan molekul DNA.
6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan,
semakin cepat pergerakan molekul DNA.
7. Larutan
buffer elektroforesis
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan
konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA (Wolfe, 1993).
Gambar 1. Pola Pita Elektroforesis
DNA Kromosomal Isolat Bakteri
Berdasarkan dari
hasil di atas, terlihat bahwa terbentuk 14 pita DNA ladder pada Marker (M).
Bedasarkan pita tersebut, 3 pita DNA ladder dengan ukuran DNA sebesar 6000 bp,
3000 bp, dan 1000 bp lebih terlihat jika dibandingkan dengan pita DNA ladder
lainnya. Berdasarkan skala pada transluminator UV, jarak sampel terhadap
sumuran berada pada jarak 4 cm. Pada gambar di atas, hasil terlihat jelas pada
sampel 1b-4b. Sedangkan, pada sampel 5b dan 6b diperkirakan adanya kesalahan
dalam memasukkan sampel ke dalam sumuran. Kesalahan tersebut dapat berupa
tertusuknya gel agarosa saat pemauskan sampel.
Pada tahapan pemasukan sampel sebelum proses elektroforesis,
pada sampel hasil PCR (1a-6a dan 1b-6b) tidak diberikan campuran loading dye
disebbakan pada tahap PCR, sampel tersebut telah ditambahkan kit Instagene
Matrix berupa 2x Dream Taq Green RM + Dye. Kit ini kandungan
yang terdapat di dalamnya yaitu air dan polystyrene-divinylbenzene iminodiacetate
(Bio-Rad, 2015).
Tabel 1. Jarak Migrasi DNA Ladder
Ukuran DNA (bp)
|
Jarak Migrasi (mm)
|
10000
|
23
|
8000
|
25
|
6000
|
27
|
5000
|
28
|
4000
|
30
|
3500
|
31
|
3000
|
33
|
2500
|
35
|
2000
|
38
|
1500
|
41
|
1000
|
45
|
750
|
48
|
500
|
52
|
250
|
|
Gambar 2. Kurva Standar DNA Ladder
Berdasarkan hasil di atas, terlihat bahwa jarak terdekat dari
sumuran terdapat pada ukuran DNA 10000 bp sebesar 23 mm dan jarak terjauh dari
sumuran terdapat pada ukuran DNA 500 bp sebesar 52 mm. Hasil pada tabel 1
ditunjukkan dengan kurva standar DNA ladder pada gambar di atas. Kurva tersebut
menunjukkan bahwa semakin besar ukuran pita DNA ladder maka jarak migrasi akan
semakin dekat dengan sumuran. Kurva tersebut dibuat dengan tujuan sebagai acuan
standar skala dalam menentukan jarak pita sampel DNA terhadap DNA marker/ DNA
ladder.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum di atas,
dapat disimpulkan bahwa isolasi DNA bakteri 16S RNA menghasilkan 3 tabung
sampel ekstraksi dari bakteri Bacillus
cereus dan 3 tabung sampel dari Acebacter
xylinum. Pada tahap amplifikasi dengan PCR, dihasilkan 12 tabung sampel
dengan 2 macam formula yang dibedakan berdasarkan komposisi volume dari DNA
template serta komposisi primer. Pada tahapan elektroforesis dihasilkan 14 pita
DNA ladder dan 4 pita sampel yang terlihat sejajar dengan pita Marker.
SARAN
Praktikum harus dilakukan dengan
langkah-langkah yang tepat sesuai dengan yang diajarkan agar mendapatkan hasil
yang maksimal. Jumlah komposisi dan takaran bahan harus tepat untuk mendapatkan
hasil yang maksimal dan sesuai dengan yang diharapkan. Pengunaan alat dan cara
pemakaiannya harus benar dan sesuai dengan instruksi agar mengurangi persentase
kegagalan praktikum.
DAFTAR PUSTAKA
Abinawanto, R. Lestari, A. Bowolaksono, M. Dian, D. P.
Astuti & H. Yasmin. 2011. Pedoman praktikum
genetika dasar. PT. Pandu Aksara, Jakarta Timur: iii + 77 hlm.
BIO-RAD. 2015. Safety Data Sheet. OSHA HCS.
BIO-RAD. 2015. Safety Data Sheet. OSHA HCS.
Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis.Amersham
Biosciences : USA.
Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed
field gel electrophoresis: a practical guide. Academic Press, Inc., San Diego.
Boffey, S. A. (1984). Isolation
of high molecular weight DNA, in Methods in Molecular Biology, vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana,
Totowa, NJ.
Campbell, N.A. Jane B. reece dan Lawrence
G. Mitchell. 2008. Biologi edisi 8 , Jilid 1. Penerbit Erlangga.
Jakarta.
Campbell, N.A., J. B. Reece & L.
G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga : Jakarta.
Davis, L., M. Kuehl, & J.
Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed.
Appleton & Lange, Norwola.
Fairbanks, D.J., W.R. Andersen.
1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole Publishing
Company, New York.
Fatchiyah,
Arumingtyas Laras. E, Widyarti Sri, dan Rahayu Sri. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar
Analis. Erlangga. Jakarta
Gardner, E.J., M.J. Simmons, &
D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8th ed.
John Wiley & Sons Inc., New
York.
Handoyo, D. & R. Ari. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR 9: 17-28. Jean,
Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal
of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Jusuf, M. 2001. Genetika I Struktur
dan Ekspresi Gen. Penerbit Sagung Seto. Bogor. Kimball. J. 2005.Biologi. ed. ke -5. jilid 1. terj
dari Biology. 5th ed, oleh Prof. DR. Ir. H. Siti Soetarmi T. Erlangga. Jakarta: xiii +
333 hlm.
Klug, W.S., M.R. Cummings.
1994. Concept of genetics 4th ed. Merrill
Publishing Co. : Columbus, Ohio.
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010.
Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in agarose gel electrophoresis.Tropical
Biomedicine 27(2): 351-354 (2010).
Lisdiyanti. 1997. Polymerase
Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek : Bogor.
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel
Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka,
Croatia.
Martin, R. 1996. Gel
electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford.
Russell, P. J. 1994. Fundamentals
of genetics. Harper Collins College Publishers, New York.
Sunarno et al. 2014. Metode Cepat Ekstraksi DNA Corynebacterium diphtheria untuk Pemeriksaan PCR. Departemen
Mikrobiologi Klinik. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Suryo. 2004. Genetika. Gadjah Mada University
Press. Yogyakarta.
Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan
Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked Oligonucelotide
Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. WARTAZOA Vol.
21, No.1, Th.2011.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction
to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company, Belmont.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar