ISOLASI PROTEIN DAN
ANALISIS PROFIL PITA PROTEIN DENGAN METODE
LOWRY DAN SDS-PAGE
drh. Rr. Bhintarti Suryo Hastari, M.
Biomed1) Maulana Malik Assayiddin2), Puri Dwi Nurmaulida
2), Fuzi Muchlissoh3),
Muhammad Faiz3), Mutia Afifah3), Ratna Lestyana D.3)
, Rizky Hastuti P.3
1)Dosen
Praktikum Biologi Molekular; 2)Asisten Dosen Praktikum Biologi
Molekular; 3)Praktikan
Program Studi
Biologi Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta
Abstrak
Protein
adalah biomakromolekul polipeptida yang tersusun dari sejumlah L-asam amino
yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Praktikum ini bertujuan untuk dapat
melakukan isolasi protein, menentukan kadar protein pada sampel tertentu, dapat
menganalisis masing-masing profil pita protein dari tiap sampel dan mengetahui
nilai mobilitas relatif (Rf). Sampel protein dibagi ke dalam 6 kelompok (S1,S2,
S3, S4, U1, dan S6). Isolasi dan penetapan
kadar protein dengan metode Lowry dan analisis profil pita protein melalui
teknik SDS-PAGE pada gel poliakrilamid 12,5% terhadap sampel A4. Larutan
standar yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) pada panjang gelombang (l) 774 nm. Hasil
persamaan linear kurva standar adalah y= 0,0018x + 0,0097 dengan nilai R =
0,9887. Kadar protein pada sampel S1 (41,63%), S2 (39,35%),
S3 (16,92%), S4 (0,55%), U1 (-1,66%), dan S6
(0,98%). Pita protein pada sampel A4 dengan BM 45 kDa memperlihatkan
intensitas warna yang paling jelas dan paling tebal, sehingga dapat digunakan
sebagai acuan bagi sampel yang memiliki BM di bawah 45 kDa. Pita-pita protein
dengan BM di bawah 45 kDa berada pada urutan ke-1 sampai ke-3 dari bawah. Berdasarkan
keadaan tersebut maka diperoleh lima pita yang digunakan untuk menentukan BM
protein pada tiap sampel. Nilai Rf dari sampel A4 berada pada
kisaran 0,06-0,44 yang menunjukkan bahwa hasil pemisahan protein berlangsung
baik.
Kata kunci : Kadar protein, Metode Lowry, Profil protein, SDS-PAGE
Abstract
Protein is the
polipeptide biomacromolecule consists of
some L-amino acid which connected by peptide bind. This observation is
aimed to get the protein isolation, deciding the protein amount on specific
sample, analyzing each profile of protein bands from each samples and knowing
the relative mobility value (Rf). The protein sample is divided into 6th groups
(S1,S2, S3,
S4, U1, dan S6). The isolation of protein
amount with Lowry method and analyze of protein band profile by SDS-Page
technique on 12,5% poliacrilamide gel on A4 sample. The 774 nm Bovine
Serum Albumin (BSA) is used as
standard solution. The result of standard curve linear equation is y= 0,0018x +
0,0097 with R = 0,9887. The amount of protein from S1 sample is
(41,63%), S2 (39,35%), S3 (16,92%), S4
(0,55%), U1 (-1,66%), dan S6 (0,98%). The protein band
form A4 sample with molecul mass of 45 kDa showing the clearest and
the thickest of color intensity, so it can be used as control for the sample
which have molecul mass <45 kDa. The bands of protein <45 kDa is on 1st
to 3rd rate from below. Based on this condition, five bands for deciding the
molecul mass of protein form each samples has been gotten. The Rf value on A4
sample is around 0,06-0,44 shows that protein separating process goin
well.
Key
words: Lowry
method, Protein content, Protein profile, SDS-PAGE
PENDAHULUAN
Protein adalah biomakromolekul polipeptida yang tersusun
dari sejumlah L-asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida, berbobot
molekul tinggi dari 5.000 sampai berjuta-juta. Protein terdiri dari
bermacam-macam golongan makro molekul yang heterogen namun semuanya merupakan
turunan dari polipeptida dengan Berat molekul (BM) yang tinggi. Unsur yang ada pada hampir semua protein
adalah Hidrogen, Oksigen, Nitrogen, dan Belerang.
Ditinjau dari strukturnya, protein dibagi ke dalam dua
golongan besar, yaitu golongan protein sederhana dan protein gabungan. Protein
sederhana adalah protein yang hanya terdiri dari molekul-molekul asam amino,
sedangkan protein gabungan adalah protein yang terdiri dari protein dan gugus
bukan protein.
Pemisahan molekul protein dari makromolekul yang lain atau pemisahan
protein dari sifat tertentu dari prosedur lainnya memerlukan prosedur isolasi
protein. Tahap awal isolasi dapat menggunakan pengendapan dengan garam ammonium
sulfat yang dipengaruhi faktor jumlah dan posisi gugus polar, BM, pH serta suhu
larutan (Poedjiadi,2007). Protein yang telah diperoleh dari teknik isolasi
selanjutnya dapat dianalisis secara kualitatif maupun kuantitatif. Beberapa
metode yang biasa digunakan, yaitu metode Biuret, Lowry, dan sebagainya.
Metode Lowry
merupakan pengembangan dari metode Biuret dan membutuhkan pereaksi lain, yakni Folin-Ciocalteauphenol yang
bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein
sehingga dihasilkan warna kebiruan yang dapat dibaca oleh spektrofotometer
uv-vis pada panjang gelombang 500-750 nm, tergantung tingkat sensitivitas yang
dibutuhkan (Soeharsono,2006).
Analisis SDS-PAGE merupakan prosedur dasar dalam banyak
aplikasi analisis protein. Poliakrilamida dapat memisahkan protein dengan
kisaran Berat Molekul 500 - 250.000 atau polinukleotida dengan kisaran 5-2.000 pasang
basa (bp) (Hermansyah,2012).
Oleh karena itu, praktikum ini bertujuan untuk dapat
melakukan isolasi protein, menentukan kadar protein pada sampel tertentu dan
dapat menganalisis masing-masing profil pita protein dari tiap sampel dan
mengetahui nilai mobilitas relatif (Rf).
MATERIAL
DAN METODE
Praktikum ini dilakukan pada tanggal
10-17 Oktober 2016 di Laboratorium Fisiologi dan Laboratorium Pangan, Pusat
Laboratorium Terpadu (PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Bahan-bahan yang digunakan dalam
praktikum ini adalah sampel protein, BSA 200 ppm, pereaksi A CuSO4
1%, pereaksi B Na2CO3 2%, folin, dan larutan kalibrasi
10, 20, 40, 80, 160 ppm, gel poliakrilamid-SDS 10%, buffer sampel, buffer elektroda
(10x), larutan pewarna (Coomassie Brilliant Blue
R-250), larutan pencuci, isobutanol, penanda berat molekul broadrange
(Biorad) 200 kDa, β-merkaptoetanol dan agar nobel 2%.
Alat-alat yang digunakan dalam adalah
mikrotube, spektrofotometer UV-Vis,
peralatan elektroforesis, pipet tetes, pipet volumetrik, mikropipet dan
mikrotip, sarung tangan, erlenmeyer, parafilm, klem, vortex, penangas air,
sentrifus mikro dan power supply.
Isolasi
Protein dan Pengukuran Kadar Protein (Metode Lowry)
Kadar protein dalam sampel protein
diukur dengan menggunakan metode Lowry. Sebanyak 1 ml larutan sampel
ditambahkan dengan 5 ml campuran pereaksi A (20 mM CuSO4.5H2O
dan 30 mM Na-sitrat) dan pereaksi B (0,1 M Na2CO3 dan 0,1 M NaOH). Campuran
reaksi dihomogenkan dengan vortex dan didiamkan 10 menit. Selanjutnya 0,5 ml
larutan D (reagan Folin ciocalteu 1 N) ditambahkan ke dalam campuran
reaksi kemudian dihomogenkan dengan vortex dan didiamkan selama 30 menit.
Kadar protein ditentukan dengan bantuan
kurva standar BSA. Variasi konsentrasi BSA dalam kurva standar mencakup
konsentrasi protein dalam sampel ekstrak protein. Variasi serial konsentrasi yang
digunakan dalam kurva standar adalah 0, 10, 20, 40, 80, dan 160 ppm dan diukur
absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 774
nm. Penentuan kadar protein dalam suatu sampel ekstrak protein dilakukan dengan
menggunakan persamaan regresi linier yang diperoleh dari grafik pada larutan
standar.
Analisis
Profil Pita Protein melalui Teknik SDS-PAGE
Persiapan
Sampel
Sampel buffer dimasukkan ke
dalam sampel protein (1:1) dalam tabung Eppendorf. Sampel dipanaskan pada suhu
100˚C selama 5 menit. Jika sampel tidak langsung digunakan maka disimpan
terlebih dahulu pada suhu 20˚C.
Persiapan Separating
Gel dan Stacking Gel
Tabung propilen 50 ml disiapkan terlebih
dahulu. Setelah itu, dimasukkan stok akrilamid sebanyak 3,125 ml, 2,75 ml 1M
Tris pH 8,8, akuabides 1,505 ml (tabung ditutup dan digoyang perlahan), 75µl SDS-10% (tabung ditutup dan digoyang perlahan),
75
µl APS (tabung ditutup dan digoyang perlahan), dan 6,25 µl TEMED
(tabung ditutup dan digoyang perlahan).
Larutan dituang ke dalam plate pembentuk gel dengan menggunakan 1 ml sampai batas
yang tertera pada plate. Setelah itu ditambahkan akuades di atas larutan gel dalam plate. Gel dibiarkan memadat kurang lebih
30 menit. Setelah itu air yang menutupi separating gel dibuang. Kemudian
pembuatan stacking gel 3%, prosesnya sama dengan pembuatan separating
gel, akan tetapi yang membedakan adalah volume larutannya ( bis-akrilamida 30% 0,45 ml, 1 M Tris pH 6,8 0,38 ml,
aquabides 2,11 µl, SDS 10% 30 µl, TEMED 5 µl, dan APS
10% 30 µl.
Pemasukan Sampel
Plate yang berisi gel dimasukkan
ke dalam chamber elektroforesis. Setelah itu, running buffer dituang
sampai bagian atas dan bawah terendam. Gelembung udara pada dasar gel
atau di antara sumur sampel dihilangkan. Sebanyak 10-20 µl sampel
dimasukkan ke dalam sumuran dengan syringe Hamilton. Syringe dibilas sebanyak
tiga kali dengan running buffer sebelum digunakan untuk memasukkan
sampel yang berbeda pada sumur gel berikutnya.
Running Sampel
Perangkat
elektroforesis dihubungkan dengan sumber listrik. Setelah itu, running
dikondisikan pada arus konstan 120 Volt selama kurang lebih 120 menit sampai tracking
dye mencapai jarak 0,5 cm dari dasar gel. Kemudian running buffer
dituang dan gel diambil dari plate.
Pewarnaan
Gel dengan Coomasie Brilliant Blue
Larutan staining disiapkan untuk
mewarnai protein pada gel dan larutan destaining untuk menghilangkan warna pada
gel serta memperjelas pita protein. Setelah itu gel direndam pada 20 ml staining
solution sambil digoyang ± 15 menit. Lalu larutan staining dituang
kembali pada wadahnya. Setelah itu, dicuci dengan air beberapa kali lalu gel
direndam dalam 50 ml larutan destaining sambil digoyang ± 30 menit atau
sampai pita protein terlihat jelas.
HASIL
Konsentrasi yang digunakan dalam kurva
standar adalah dari 0 sampai 160 mg/ml
dengan variasi konsentrasi 0, 10, 20, 40, 80, dan 160 mg/ml dan diperoleh nilai
absorbansi hasil analisis kadar protein pada kurva standar (Tabel 1). Absobansi
standar berada pada panjang gelombang (l)
774 nm (Gambar 1).
Tabel 1. Nilai
absorbansi konsentrasi larutan BSA (sebagai standar)
Konsentrasi
(mg/ml)
|
Nilai l pada 774 nm
|
0
|
0
|
10
|
0,016
|
20
|
0,053
|
40
|
0,088
|
80
|
0,192
|
160
|
0,297
|
Tabel 2. Nilai absorbansi
sampel, Persamaan kurva standar = y
= 0,001894x + 0,009717
Sampel
|
Absorbansi
Sampel (Y)
|
Y
= 0,001894x + 0,009717
|
FP
(103)
|
mg/mLxFP
(x)
|
Kadar
Protein (mg/g)
|
Kadar
Protein
(%
g/g)
|
S1
|
0,174
|
86,7386
|
24
|
2.081.726,4
|
416,34
|
41,63
|
S2
|
0,165
|
81,9868
|
24
|
1.967.683,2
|
393,53
|
39,35
|
S3
|
0,170
|
84,6267
|
10
|
846.267
|
169,25
|
16,92
|
S4
|
0,015
|
2,7893
|
10
|
27.893
|
5,57
|
0,55
|
U1
|
-0,006*
|
-8,2983*
|
10
|
-82.983*
|
-16,60*
|
-1,66*
|
S6
|
0,019
|
4,9013
|
10
|
49.013
|
9,80
|
0,98
|
Hasil dari perhitungan pada tabel
larutan standar dibuat kurva linear dengan nilai konsentrasi sebagai sumbu-x
dan nilai absorbansi sebagai sumbu-y. Kurva absorbansi standar BSA pada Gambar
1., membentuk puncak kecil di sekitar 500 nm yang
dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah
puncak besar di sekitar 770 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein
dengan konsentrasi rendah.
Hasil pengukuran konsentrasi kontrol an-absorbansi
standar dimasukkan ke dalam persamaan linear sehingga diperoleh kurva standar
protein. Berdasarkan perhitungan tersebut maka diperoleh persamaan linear y=
0,0018x + 0,0097. Kurva dari persamaan linear tersebut memperlihatkan slop
positif dengan kontrol garis yang mendekati 1, yaitu nilai R = 0,9887 (Gambar
2).
Hasil pengukuran absorbansi dari keenam
sampel terlihat pada tabel 2. Nilai absorbansi sampel tertinggi terdapat pada S1
(0,174) dan nilai absorbansi terendah terdapat pada U1 dengan hasil
absorbansi menunjukkan nilai negatif (-0,006) karena di bawah nilai absorbansi
kurva standar BSA. Nilai absorbansi dari keenam sampel menunjukkan
perbedaan dikarenakan jenis sampel protein
yang digunakan berbeda-beda.
Hasil perhitungan persentase kadar protein
dalam sampel pada tabel 2 di atas, menunjukkan bahwa kadar protein pada sampel
S1 sebesar 41,63%, S2 sebesar 39,35%, S3
sebesar 16,92%, S4 sebesar 0,55%, U1 sebesar -1,66% dan S6
sebesar 0,98%. Dari hasil tersebut, terlihat bahwa kadar protein tertinggi
adalah S1 dan kadar protein terendah pada U1.
Sampel S1 dan S2
memiliki konsentrasi yang pekat, sehingga perlu pengenceran total hingga 24.000
kali, sedangkan untuk sampel lainnya hanya diperlukan faktor pengenceran sebanyak
10.000 kali. Hasil perhitungan kadar protein pada sampel U1 menunjukkan
bahwa pada sampel U1 memiliki kandungan ekstrak protein yang sangat
kecil hingga tidak terdeteksi oleh spektrofotometri uv-vis.
Gambar 1. Absorbansi
Standar (l) BSA pada 774
nm
|
Gambar 2. Kurva
Kalibrasi Larutan Standar BSA
Gambar 3.
Profil SDS-PAGE dari sampel D2, D1, D3, S2,
A1, A4, A4
Tabel
3. Nilai Rf (Retadartation Factor) pada sampel
protein A4
Running sampel dalam
sumuran
|
Jarak pita protein dari batas atas gel
pemisah (cm)
|
Jarak dari tracking dye dari batas
atas gel pemisah (cm)
|
BM Marker (kDa)
|
Rf (Retadartation factor) (x)
|
A4
|
0,3
|
4,5
|
200
|
0,067
|
0.3
|
4,5
|
115
|
0,067
|
|
0,5
|
4,5
|
97,5
|
0,111
|
|
0.8
|
4,5
|
66
|
0,178
|
|
2
|
4,5
|
45
|
0,444
|
|
|
|
31
|
|
|
21,5
|
||||
14,5
|
Hasil yang tertera pada tabel 3, menunjukkan
bahwa nilai Rf dari sampel A4
berada pada kisaran 0,06 – 0,44. Nilai Rf tertinggi berada pada pita ke-5.
Rentang nilai Rf tersebut berati bahwa pemisahan yang terjadi berlangsung
dengan baik.
PEMBAHASAN
Protein dapat dianalisis secara
kuantitatif dan kualitatif. Analisis kuantitatif protein biasanya menggunakan
sprektofotometer dengan panjang gelombang tertentu tergantung pada jenis
protein dan preaksi yang dipakai (Fatchiyah et al, 2011). Penentuan kadar
protein pada praktikum ini menggunakan metode Lowry, yakni metode
pengkombinasian pereaksi Biuret dengan pereaksi lain (Folin) yang bereaksi
dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein. Reaksi ini akan
menghasilkan warna kebiruan (Hawab, 2004), sehingga pada uji protein, tabung pada
sampel S1 dan S2 memiliki warna biru yang lebih pekat dan
menjadi biru muda pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi.
Pembuatan larutan standar dengan
berbagai variasi konsentrasi bertujuan untuk menentukan kadar protein dalam
suatu sampel. Tujuan digunakannya metode Lowry pada praktikum pengukuran kadar
protein karena metode ini memiliki beberapa kelebihan. Pertama, metode ini
didasarkan pada kestabilan ikatan protein dengan protein Lowry sehingga
absorban yang terbaca akan relatif stabil. Selain itu, karena interfensi zat
lain menjadi lebih kecil disebabkan hanya protein yang berikatan dengan protein
Lowry (Suryohastari, 2016). Menurut Mickelson dan Corton (2004), metode Lowry memiliki
tingkat pengukuran yang lebih sensitif (1 μg hingga 100 μg), sehingga diperoleh
data yang lebih valid. Namun kelemahannya adalah metode ini hanya dapat
mengukur molekul peptida pendek (Lowry., et al, 1951).
Terdapat reagen pendeteksi fenolik yang
digunakan dalam metode ini, yaitu folin. Folin berperan dalam penentuan
konsentrasi protein. Dalam bentuk sederhana, folin dapat mendeteksi residu
tirosin karena kandungan fenolik dalam residu tersebut dapat mereduksi
fosfotungsat dan fosfomolibda menjadi tungsten dan molybdenum yang berwarna
biru (Hawab, 2004). Selain itu, dalam metode ini juga terlibat dua buah
pereaksi(pereaksi A dan pereaksi B) atau dikenal dengan pereaksi Biuret.
Kompleks Cu (II) protein terbentuk
seperti metode Biuret, yang dalam suasana alkalis, Cu (II) akan tereduksi
menjadi Cu (I), kemudian ion Cu+ akan mereduksi reagen
Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat dan
phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum
blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino)
terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara
kolorimetri (Soeharsono, 2006).
Terdapat beberapa zat
yang dapat mengganggu penetapan kadar protein dengan metode Lowry, diantaranya
adalah buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol, Tricine,
EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfihidril, disulfida, fenolat, asam urat,
guanine, xanthine, magnesium, dan kalsium. Interferensi agen-agen tersebut
dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferensi tersebut. Oleh karena itu,
dianjurkan menggunakan blanko untuk mengoreksi absorbansi. Interferensi yang
disebabkan oleh deterjen, sukrosa, dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan
SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein ( Lowry., et al,
1951).
Berdasarkan pada praktikum ini digunakan elektroforesis vertikal dengan
menggunkan metode SDS PAGE dengan gel berbahan dasar polikrilamida karena
sampel yang digunakan adalah sampel protein. Pemilihan komposisi stacking
gel dan separating gel didasarkan pada berat molekul protein
yang akan di – running, bila sampel protein yang akan di running belum
diketahui berat molekulnya, maka digunakan gel dengan komposisi 12,5% terlebih
dahulu, jika kemudian saat running terjadi loss
protein, maka komposisi gel dinaikkan menjadi 25% dan seterusnya (Davidson,
2001).
Separating gel ini berfungsi
untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya, bahan
yang digunakan dalam praktikum, yaitu akrilamid 30% sebagai bahan untuk
membentuk pori-pori dalam gel, agar protein dapat terpisah berdasarkan
ukurannya. 1 M Tris pH 8,8 berperan untuk menstabilkan pH buffer agar muatan
dari protein tidak berubah. Akuades digunakan sebagai pelarut polar dan sebagai
media polar untuk aliran listrik dalam gel. Sodium Dodesil Sulfat (SDS) digunakan
untuk memutuskan ikatan disulfida dari protein agar menjadi unfolding
dan menyelubungi protein dengan muatan negatif. Ammonium Persulfat (APS)
digunakan sebagai katalisator dalam polimerasi gel poliakrilamid, dan TEMED
digunakan sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat
dan juga diginakan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir
agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan
tercampur (Davidson, 2001).
Kondisi pH yang digunakan dalam separating
gel, yaitu 8,8. Hal tersebut bertujuan untuk mendapatkan pori-pori yang
lebih kecil sehingga protein akan terseparasi dengan baik saat running
dan agar didapatkan protein tetap dalam keadaan bermuatan negatif. Larutan gel
yang telah dibuat dimasukkan dalam plate untuk mencetak gel. Pemberian akuades
di atas separating gel yang setengah padat bertujuan untuk membuat
permukaan separating gel datar.
Gel kedua yaitu stacking gel yang
berfungsi untuk tempat menata sampel protein sebelum proses running
dimulai. Bahan yang digunakan dalam pembuatan stacking gel ini yaitu akrilamid-bis
sebagai pembentuk pori-pori untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran yang
dimilikinya. Tris pH 6,8 berfungsi untuk mempertahankan pH protein agar tidak
berubah, sehingga protein akan tersusun secara berjajar pada bagian bawah dari stacking
gel (Janson, 1998). Akuades sebagai pengencer, pelarut, dan pemberi kondisi
polar untuk melancarkan arus listrik. Sisir dipasang untuk mencetak sumuran
tempat sampel dimasukkan dalam gel.
Komposisi gel akan mempengaruhi hasil running
sampel protein. Gel berperan sebagai pori atau saringan yang akan menyaring
protein berdasarkan ukuran molekul. Protein dengan berat molekul kecil akan
turun terlebih dahulu dengan cepat menuju ke dasar gel dan protein dengan berat
molekul besar akan tertahan di gel bagian atas. Jika komposisi gel yang
digunakan tidak sesuai, misalnya komposisi gel terlalu kecil maka pori dari gel
menjadi longgar sehingga protein dengan berat molekul kecil akan terus turun,
sedangkan jika komposisi gel terlalu besar maka pori dari gel menjadi rapat
sehingga protein dengan berat molekul besar akan tertahan di atas (Janson,
1998).
Penggunaan larutan Reducing Sample Buffer (RSB) sebagai tracking dye berfungsi
untuk menandai protein yang tersangkut di pori gel sebagai band.
Pemanasan protein dilakukan sebelum pemberian RSB dengan tujuan untuk
melepaskan ikatan protein yang rumit menjadi sebuah ikatan sederhana yang akan
lebih mudah untuk dilakukan proses running elektroforesis.
Penambahan larutan RSB dengan
perbandingan 1:1 karena RSB ini mampu memutus ikatan disulfida protein sehingga
didapatkan protein dalam bentuk linier yang nantinya akan memudahkan separasi
protein tersebut dalam gel saat running. Di dalam RSB terdapat kandungan
1 M Tris-HCl pH 6,8 untuk menjaga kondisi pH dari sampel protein, gliserol 50%
berfungsi untuk menambah berat sampel sehingga mudah turun, SDS 10% berfungsi
sebagai agen pereduksi yang memutuskan ikatan
Saat preparasi sampel digunakan
disulfida sehingga protein berbentuk linier dan bermuatan negatif pada protein,
fungsi pembentukan muatan negatif ini untuk memudahkan separasi menuju kutub
positif saat dilewatkan arus (Janson, 1998).
Adapun kandungan yang lain yaitu
terdapat 2-merkaptoethanol yang berfungsi untuk membantu reaksi SDS dalam
memecah ikatan disulfida dari protein, dan Bromophenol Blue 1% sebagai penanda
atau sebagai tracking dye untuk mempermudah dalam pengamatan pergerakan
protein saat running (Janson, 1998). Larutan RSB yang digunakan dalam
sampel tanaman sedikit berbeda dari sampel non tanaman, yaitu pada RSB untuk
tanaman perlu ditambahkan DTT dan EDTA. Penambahan DTT ini untuk memecah ikatan
disulfida dengan mendegradasi ikatan alifatik disulfide menjadi rantai
polipeptida tunggal.
Jenis tanaman-tanaman tertentu dapat
menghasilkan senyawa-senyawa metabolit sekunder, sehingga untuk memaksimalkan
pemecahan disulfida yang dilakukan oleh SDS dan 2-merkaptoethanol diperlukan
penambahan DTT dan EDTA (Janson, 1998). Setelah penambahan larutan RSB, sampel
protein dipanaskan untuk mengoptimalkan proses dari pendenaturasian protein
(Sudarmanto, 2008). Pada praktikum ini pemanasan dilakukan selama 5 menit di
air mendidih dan tidak lebih dari 7 menit karena akan menyebabkan denaturasi
protein.
Aliran listrik yang digunakan sebesar
120 Volt selama 2 jam yang berfungsi untuk memberi muatan pada protein untuk
bergerak melewati pori gel dan bergerak dari atas ke bawah gel sesuai dengan
berat molekul sampel protein tersebut dan agar protein dapat terseparasi dengan
baik. Protein dengan berat molekul kecil akan bergerak terlebih dahulu dengan
cepat melewati pori sampai batas di mana pori tidak cukup besar untuk melewati
pori gel. Batas itulah yang terlihat sebagai band pada gel.
Aliran muatan listrik mengalir ke
protein melewati running buffer yang diisikan pada kit elektroforesis
yang berisi gel yang di running. Setelah itu dilakukan staining
atau pewarnaan. Larutan staining yang digunakan dalam praktikum ini
yaitu CBB R-250 (Coomasie Brilliant Blue), CBB ini sensitif terhadap
protein yang memiliki ukuran yang berkisar antara 0,5 hingga 20 mikrogram
(Janson, 1998). Penggoyangan perlu dilakukan untuk megoptimalkan reaksi staining
yang dilakukan oleh CBB. Pencucian dengan aquades berfungsi untuk membilas dan
menghilangkan CBB yang mungkin masih tersisa pada gel. Selanjutnya dilakukan
perendaman pada larutan destaining untuk menghilangkan CBB yang tersisa dan
memperjelas band protein yang terbentuk serta untuk menghilangkan CBB
yang tidak berada pada band protein.
Pemberian kertas saring saat perendaman
pada larutan destaining bertujuan memaksimalkan pembersihan larutan CBB.
Setelah itu, dilakukan pencucian lagi dengan akuades untuk menghilangkan sisa
larutan destaining dan menghentikan pewarnaan yang dilakukan oleh
larutan destaining. Gel di scan untuk mendapatkan visualisasi
lebih baik untuk analisis selanjutnya (William, 2001).
Kemudian berat molekul protein
diidentifikasi dengan menentukan kurva baku dari marker protein dengan
menggunakan Log dari berat molekul dan RF (hasil bagi tracking band dan tracking
total). Setelah diketahui persamaan dari kurva baku, maka persamaan
tersebut dapat digunakan untuk menghitung berat molekul dari sampel protein
yang digunakan pada saat running (Rick, 2008).
Analisis profil pita protein dengan teknik Sodium Dodecyl Sulfate – Poly
Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dapat digunakan untuk melihat
profil protein dan menentukan BM atau berat molekul suatu protein (Stryer,
1995).
Metode gel satu dimensi umumnya menggunakan
sodium dodesil sulfat (SDS) yang diperankan untuk solubilisasi, denaturasi dan
memberikan muatan negatif pada suatu protein (Coligan, 1996). Protein dapat
dipisahkan dari protein jenis lain atau dari molekul lain berdasarkan ukuran,
kelarutan, muatan dan afinitas ikatan. Pemisahan protein merupakan tahap yang
harus dilakukan untuk mempelajari karakter dan fungsi protein (Poedjiadi, 2007).
Berbagai jenis protein pada suatu sampel akan terpisah-pisah pada gel
poliakrilamid yang tergantung pada mobilitasnya, dengan demikian pada jalur
pergerakan protein akan didapatkan jajaran protein yang disebut sebagai pita
protein yang akan memisah berdasar ukuran BM protein (Fatchiyah et al.,
2011).Tebal dan tipisnya pita-pita protein yang terlihat pada gel poliakrilamid
merupakan gambaran dari banyaknya protein yang terkandung dalam berat molekul
suatu protein.
Pada penelitian Gunanti (2010)
menjelaskan bahwa tebal dan tipisnya pita protein pada hasil SDS-PAGE
disebabkan karena terdapat perbedaan secara genetik antara protein tersebut. Pada
gel poliakrilamid 12,5% hasil SDS-PAGE terdapat pita-pita protein yang dapat
dihitung berat molekulnya. Penentuan berat molekul terhadap profil relatif pada
tiap sampel difokuskan pada pita-pita yang berat molekulnya berada di bawah kDa.
Pita protein dengan BM 45 kDa pada hasil elektroforesis SDS-PAGE dalam gel
poliakrilamid 12,5% memperlihatkan intensitas warna yang paling jelas dan
paling tebal, sehingga dapat digunakan sebagai acuan bagi sampel yang memiliki
BM di bawah 45 kDa.
Pita-pita protein dengan BM di bawah 45
kDa berada pada urutan ke-1 sampai ke-3 dari bawah. Berdasarkan keadaan
tersebut maka diperoleh lima pita yang digunakan untuk menentukan BM protein
pada tiap sampel. Berat molekul protein yang terlihat pada setiap jalur sampel
ditentukan melalui nilai Rf dari masing-masing pita protein. Nilai Rf
dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa pustaka menyatakan nilai Rf yang baik
adalah yang menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah berkisar antara
0,2-0,8.
KESIMPULAN
Nilai kadar protein pada tiap sampel adalah S1
(41,63%), S2 (39,35%), S3 (16,92%), S4
(0,55%), U1 (-1,66%) dan S6 (0,98%) dengan persamaan
linear y= 0,0018x + 0,0097 dan nilai R = 0,9887. Nilai Retadartation factor (Rf)
tertinggi ada pada pita ke 5, dengan kisaran
nilai Rf sebesar 0,06-0,44 yang berarti terjadi pemisahan protein yang cukup
baik.
SARAN
Sebaiknya kuvet yang
berisi blanko dan sampel dipastikan
dalam keadaan kering
agar pembacaan nilai absorbansi lebih akurat serta dalam
pengambilan larutan yang berada di dalam mikrotube digunakan sebuah alat khusus
guna mencegah sisa larutan tidak menempel di dinding mikrotube.
DAFTAR
PUSTAKA
Coligan
J. E. 1996. Current protocols in pro-tein science. John Wiley
& Sons, Inc. Unit 4.7.
Davidson.
2001. SDS- PAGE. http://www.bio.davidson.edu/COURSES/GENOMICS/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html.
Diakses tanggal 24 Oktober pukul
03.00 WIB.
Fatchiyah,
E.L., Arumingtyas S., Widyarti, & Rahayu, S. 2011. Biologi molekuler
prinsip dasar analisis. Penerbit Erlangga. Jakarta.
Gunanti,
M., Ulia, F., Sri, D. 2010. Karakterisasi
protein Larnea cyprinacea dengan metode
elektroforesis SDS-PAGE. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, 2(1), 61-66.
Hawab,
HM. 2004. Pengantar Biokimia. Bayu Media Publishing. Jakarta.
Hermansyah,. 2012. Penuntun
Praktikum Biokimia. MIPA UNSRI. Inderalaya.
Janson,
J.C, L.Ryden. 1998. Protein Purification Principles,
High-Resolution Methods and Applications. Second Edition.
Lowry,
Rosenbrough, Farr, Randall. 1951. Protein Measurement with The Folin Phenol
Reagent. Kluwer Academic Publishers. New York.
Mickelson, R., & Eduardo Corton. 2004. BioanalyticalChemistry, Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.
Poedjiadi, Anna. 2007. Dasar
Biokimia. UI Press. Jakarta.
Rick. 2008. Molecular station role
of SDS in SDS-PAGE gel electrophoresis. . http://www.molecularstation.com/sds-page -gel
-electrophoresis/. Diakses tanggal 24 Oktober 2016. Pukul 22.00 WIB
Soeharsono.
2006. Biokimia 1.UGM Press. Yogyakarta.
Stryer,
L. 1995. Biokimia. penerjemah; Soebianto S, editor. Terjemahan dari: Biochemistry.
Jakarta: EGC Penerbit Buku Kedokteran.
Sudarmanto,
Arie. 2008. Protein. http://ariebs.staff.ugm.ac.id. html. Diakses
tanggal 24 Oktober. Pukul 22.00 WIB.
Suryohastari, Bhintarti Rr. 2016. Analisis Protein Defensin
dari Biji Jinten Hitam (Nigella sativa L.)
pada Mencit (Mus musculus) yang
Diberi Biji Jinten Hitam Melalui Teknik SDS-Page. Jurnal Biologi Al-Kauniyah.
9(1), 26-36.
William.
2001. SDS PAGE Gel Elektrophoresis. http://web. chemistry.gatech.edu/~williams/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/page_protein.html. Diakses
tanggal 24 Oktober 2016 pukul 06.00 WIB
Tidak ada komentar:
Posting Komentar