UJI
KUALITATIF DAN UJI KUANTITATIF DNA
QUALITATIVE AND QUANTITATIVE TEST OF DNA
drh. Rr. Bhintarti Suryo Hastari, M. Biomed, Festy
Aulyaur Rahmah, S.Si , Maulana Malik Assayiddin, Puri Dwi Nurmaulida,
Ratna Lestyana Dewi*
Program
Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif
Hidayatullah Jakarta
Abstrak
Deoxyribonucleic acid (DNA)
merupakan senyawa kimia penting pada makhluk hidup karena mengandung informasi
genetik dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Isolasi DNA dilakukan untuk memisahkan DNA dari bahan lain dengan
prinsip sentrifugasi dan presipitasi. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk
menentukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau
komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam
larutan dengan uji kualitatif. Tujuan praktikum ini adalah mampu melakukan
isolasi DNA kromosomal bakteri dan juga melakukan uji kuantitatif DNA
kromosomal. Metode dalam praktikum ini yaitu preparasi sampel, isolasi DNA,
amplifikasi, elektroforesis horizontal gel agarosa, uji kuantitatif dengan
sprektofotometer, dan sequencing DNA dengan metode sanger. isolasi DNA bakteri
16S RNA menghasilkan 3 tabung sampel ekstraksi dari bakteri Bacillus cereus dan
3 tabung sampel dari Acetobacter xylinum. Pada tahap amplifikasi dengan PCR,
dihasilkan 12 tabung sampel dengan 2 macam formula yang dibedakan berdasarkan
komposisi volume dari DNA template serta komposisi primer. Pada tahapan
elektroforesis dihasilkan 14 pita DNA ladder dan 4 pita sampel yang terlihat
sejajar dengan pita Marker. Nilai kemurnian DNA berada pada kisaran 0,304-0,771
sedangkan nilai konsentrasi berada pada kisaran 25-135 µg/ml. Secara keseluruhan sampel, nilai kemurnian
DNA berada di bawah 1,8, sehingga dapat dikatakan bahwa sampel DNA kurang murni
dan kurang bersih.
Kata kunci: Amplifikasi, DNA, Purifikasi
Abstract
Deoxyribonucleic acid (DNA) is an
important chemical compound found in living organisms because it contains
genetic information from one generation to the next. Isolation of DNA is done
to separate the DNA from other materials with the principle of centrifugation
and precipitation. Quantitative DNA test is an analysis to determine the
content or the amount of DNA present in a substance or substances which
components have previously been shown the presence of DNA plasmids in the
solution with the qualitative test. The purpose of this lab is able to isolate
the chromosomal DNA of bacteria and also perform a quantitative test of
chromosomal DNA. The method in this lab is sample preparation, DNA isolation,
amplification, horizontal agarose gel electrophoresis, quantitative assay with
sprektofotometer, and DNA sequencing by the Sanger method. DNA isolation of
bacterial 16S RNA extraction produces three sample tubes from the bacterium
Bacillus cereus and 3 tube samples of Acetobacter xylinum. At this stage of
amplification by PCR, produced 12 sample tubes with 2 different formula
compositions are distinguished by the volume of DNA template and primer
composition. At that stage produced 14 DNA electrophoresis ladder and four tape
samples seen juxtaposed with a ribbon Marker. DNA purity value in the range of
0.304 to 0.771, while the concentration in the range of 25-135 pg / ml. Overall
samples, DNA purity values were under 1.8, so it can be said that the DNA
sample is less pure and less clean.
Keywords: Amplification,
DNA, Purification
PENDAHULUAN
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia paling penting pada
makhluk hidup karena mengandung informasi genetik dari satu generasi ke
generasi (Suryo, 2004). Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom.
Genom terdiri dari bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel
organisme. Bakteri termasuk organisme pokariotik yang memiliki DNA berbentuk
sirkular dan terletak di dalam sitoplasma (Jusuf, 2001). Kromosom adalah suatu struktur
makromolekul yang berisi DNA dan menyimpan informasi genetik. Sekuens DNA yang
terletak pada kromosom disebut dengan DNA kromosomal.
Kromosom merpakan
pembawa gen yang terdapat di dalam inti sel (nukleus). Kromosom terdiri dari
DNA, RNA dan protein. Kromosom terdiri atas dua bagian, yaitu sentromer yang
merupakan pusat kromosom berbentuk bulat dan lengan kromosom yang berjumlah
sepasang (Handoyo, 2001).
Isolasi
DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti
protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni
penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
Isolasi
DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua,
yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada
pada bagian atas tabung (Abinawanto, 2011).
Tahap
lanjutan dari isolasi DNA adalah amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). Teknik tersebut dapat bermanfaat
dalam memperbanyak jumlah DNA agar dapat dimanfaatkan lebih maksimal karena
jumlahnya lebih banyak. Hasil dari PCR dapat dilihat pada elektroforesis gel
untuk mengetahui visualisasi dari tahapan-tahapan di atas dan mengetahui berat molekul dari pita DNA target
(Handoyo, 2011).
Uji
kuantitatif DNA adalah suatu analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah
DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah
diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan dengan uji kualitatif. DNA
yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita
ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein
atau fenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Adanya perbedaan penyerapan
cahaya UV ini maka kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai
absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280, dan nilai kemurnian DNA
berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah, 2011).
Rasio
yang kurang dari 1,8 menunjukan bahwa preparasi DNA telah terkontaminasi baik
oleh fenol maupun protein. Rasio yang dengan nilai di atas dua menandakan bahwa
preparasi DNA telah terkontaminasi oleh RNA.
Praktikum
ini bertujuan untuk mengisolasi DNA pengkode gen 16S rrna dari bakteri Bacillus
cereus dan Acetobacter xylinum yang kemudian dilakukan uji kulitatif DNA yang
terdiri dari amplifikasi DNA dan identifikasi fragmen DNA dengan elektroforesis
horizontal gel agarose, kemudian dilanjutkan dengan uji kuantitatif dengan
sprektofotometer uv-vis.
MATERIAL DAN
METODE
Praktikum ini dilakukan pada tanggal 7, 14, 21, 28, November dan 5 Desember 2016
di Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Bahan
yang digunakan dalam praktikum ini adalah biakan koloni bakteri cair Bacillus cereus dan Asetobacter xylinum, H2O, instagene matriks, gen rRNA 16S, primer 27 F dan 1492 R, dream taq green 2x master mix +
dye, nuclease free water, peq green,
buffer TAE 1x, marker, loading dye, dan gel agarose 1%, sampel ekstraksi DNA
bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum dan akuabides.
Alat yang digunakan dalam
praktikum ini adalah mikrotube, sentrifuge, mikropipet, water bath, vortex, thermocycler
(PCR machine) tangki elektroforesis, transluminator UV, erlenmeyer, microwave, sisir, spektrofotometer, kuvet dan kamera.
Preparasi DNA Bakteri dengan Instagene Matriks
Biakan
koloni cair bakteri Bacillus cereus
dan Asetobacter xylinum diresuspensi
dalam 1 ml di dalam H2O, selanjutnya di sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Kemudian
seupernatan dibuang dengan menggunakan mikropipet, kemudian pellet ditambahkan
dengan 100µl instagene matriks strirrer
moderated speed. Selanjutnya diinkubasi di dalam water bath dengan suhu 560C
selama 30 menit, kemudian divortex selama 10 detik, dan diinkubasi kembali
dengan suhu 1000C selama 8 menit. Kemudian divortex selama 10 detik,
di sentrifuge dengan kecepatan 12.000
rpm selama 3 menit. Kemudian super natan dipindahkan ke dalam tabung baru dan
disimpan dalam suhu 40C.
PCR Gen 16S rRNA
Isolat
bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum yang ada di
microtube, masing-masing dibagi menjadi 2 tipe yaitu a untuk Acetobacter xylinum dan b untuk Bacillus cereus. Tipe a di masukkan
formula 2x dream taq green RM+dye sebanyak 12,5 µl menggunakan
mikropipet, kemudian ditambahkan DNA template sebanyak 10 µl, 10 µM primer 27F
sebanyak 1,25 µl, 10 µM primer 1492 R sebanyak 1,25 µl setelah itu, sampel
dihomogenkan menggunakan vortex dalam waktu 5 detik. Tipe b dimasukkan formula
2x dream taq green RM+dye sebanyak 12,5
µl menggunakan mikropipet, kemudian ditambahkan DNA template sebanyak 1 µl, 10
µM primer 27F sebanyak 0,5 µl, 10 µM primer 1492 R sebanayak 0,5 µl, dan
nuclease free water sebanyak 10,5 µl, setelah itu dihomogenkan menggunakan vortex dalam waktu 5 detik.
Selanjutnya, PCR di set dengan suhu pre-denaturasi 950 C selama 5
menit, denaturasi 950C selama 30 detik, anneling 510 C selama 30 detik, ektensi 720 C
selama 2 menit, final ekstensi 720C selama 10 menit, dan stop pada
suhu 40 C. Microtube disusun di dalam Thermocycler pada bagian tengah, dan ditekan tombol start dan
didiamkan hingga proses selesai.
Elektroforesis Gel Agarose
Pembuatan
gel agarose yaitu dengan memasukkan gel agarose 1% sebanyak 0,25 gram dan 25 ml
buffer TAE 1x ke dalam erlenmeyer, selanjutnya erlenmeyer dimasukkan ke dalam
microwave selama 30 menit, dimasukkan peq
green sebanyak 1 µl pada saat gel agarose bersuhu 500C yang
kemudian dihomogenkan. Selanjutnya gel agarose yang sudah homogen dimasukkan ke
dalam cetakan dengan posisi yang seimbang. Sebelum meletakkan gel agarose di
dalam cetakan, diletakkan sisir cetakan terlebih dahulu yang diletakkan pada
urutan ke 8 dan 15, setelah itu baru gel agarose dituang ke dalamnya. Gel
agarose akan berubah menjadi warna keabu-abuan jika sudah memadat. Kemudian gel
agarose dimasukkan pada chamber.
Produk PCR b dimasukkan pada sisir B dengan menggunakan mikropipet. Proses
pemasukkan sampel dilakukan dari sisi kiri menuju sisi kanan. Formula marker
terdiri dari 1 µl marker ditambah 1 µl loading
dye, dan 4 µl air, sedangkan formulasi ekstraksi sampel sebanyak 5 µl
ditambah 1 µl loading dye. Sampel
dimasukkan pada cetakan gel agarose sesuai formasi yang telah ditentukan
sebelumnya. Kemudian, lalu dilakukan tahapan running elektroforesis dengan panjang gelombang 80V, tegangan 400mA
selama 45 menit.
Transluminator UV
Hasil
running pada elektroforesis divisualisasikan menggunakan sinar UV pada
transluminator. Gel agarose diletakkan di atas transluminator UV dengan
perlahan, selanjutnya ditutup dengan penutup kaca anti sinar UV, digunakan kaca
mata pelindung anti sinar UV, selanjutnya dinyalakan saklar lampu UV dan diamati
pita DNA yang tampak dan didokumentasikan.
Uji Kuantitatif DNA
Hasil ekstraksi dithowing terlebih dahulu
untuk memastikan sampel sudah tidak terlalu dingin,
kemudian divortex selama 10 detik. Lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12.000
rpm selama 3 menit. Selanjutnya, sampel yang akan digunakan konsentrasinya
diencerkan hingga 100x (10 µl sampel DNA dan 990 µl akuabides), sampel yang
telah diecerkan lalu dimasukkan pada mikrotube baru dan divortex 10 detik.
Kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit.
Setelah itu dipindahkan ke dalam kuvet dan diukur nilai absorbansinya pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm di spektrofotometer UV-Vis.
HASIL
DAN PEMBAHASAN
Isolasi
DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA dapat
ditemukan di kromosom inti maupun di organel (Fatchiyah, 2011). Isolasi DNA
memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi
dalam larutan, purifikasi dan presipitasi. Sementara itu, prinsip utama dalam
isolasi DNA yaitu sentrifugasi dan presipitasi.
Praktikum
ini menggunakan bakteri Bacillus cereus
dan Acetobacter xylinum yang kemudian
diisolasi DNA-nya. Isolasi DNA bakteri digunakan dream taq green 2x master mix
atau yang disebut sebagai instagene
matriks, merupakan sebuah kit yang sudah diproduksi secara konvensional
yang berfungsi untuk mempercepat proses dalam tahapan isolasi DNA. Kandungan
yang terdapat di dalamnya yaitu air dan terdapat polystyrene divinyl benzeneiminodiacetate (Biosciences, 1999).
Isolasi
DNA memiliki prinsip untuk memisahkan DNA kromosom atau atau DNA genom dari
komponen sel yang lain. Setelah kultur disentrifugasi didapat endapan putih
yaitu berupa supernatant. Prinsip utama dari sentrifugasi yaitu memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul, sehingga substansi yang lebih berat
akan berada di dasar. Prinsip dari presipitasi yaitu pengendapan DNA agar
terpisah dari zat lain yang terdapat di sel (Handoyo, 2001).
Isolasi DNA bakteri menggunakan metode boiling dengan melakukan pemanasan suhu
tinggi selama beberapa menit yang menyebabkan meningkatnya permeabilitas
dinding sel yang berakibat masuknya cairan dan materi lain di sekitar sel dan
keluarnya materi dari dalam sel. Suhu tinggi berfungsi untuk inaktifasi enzim,
terutama DNA-ase yang dapat merusak DNA. Suhu yang digunakan dalam pemanasan
tergantung pada sampel yang digunakan. Ekstraksi DNA dengan metode boiling mudah untuk dilakukan karena
hanya membutuhkan waktu yang tidak terlalu lama, namun kualitas yang dihasilkan
relative lebih rendah dibandingkan dengan metode lain (Sunarno, 2014).
Polymerase chain reaction (PCR) merupakan salah satu
teknik yang bertujuan untuk memperbanyak DNA secara in vitro dalam suatu reaksi
termal. Teknik PCR terdiri atas tiga tahap yaitu denaturasi, annealing, dan polimerisasi. Denaturasi
berlangsung pada suhu 94o C selama 30 detik. Saat tahap denaturasi,
reaksi enzimatik berhenti dan ikatan hidrogen terputus sehingga DNA untai
ganda berpisah menjadi DNA untai tunggal. Annealing
berlangsung pada suhu 55o C selama 3 detik. Kemudian pada tahap
tersebut primer menempel pada DNA template di tempat yang berkomplemen dengan
sekuens primer. Tahap terakhir yaitu polimerisasi berlangsung selama 30 detik
pada suhu 72o C merupakan proses pemanjangan primer menggunakan
untai tunggal DNA sebagai cetakannya. DNA polimerase akan memasangkan dNTP yang
sesuai dengan pasangannya (Davis, 1994).
Prinsip kerja PCR (Polymerase Chain Reaction) yaitu menggunakan reaction mixture serta memanfaatkan enzim dari DNA polimerase yang
bersifat termostabil dan fragmen DNA yang pendek disebut primer. Primer
berfungsi untuk mensintesis secara langsung sekuens DNA target spesifik dari
DNA template. Reaksi sintesis tersebut terus berulang sehingga membentuk suatu
siklus (Sunarno, 2014). Adapun komponen-komponen dalam reaction mixture PCR yaitu H2O steril, fungsinya sebagai
pelarut campuran. Buffer berfungsi untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan
optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.
Buffer biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia. Komponen lainnya yaitu dNTP (deoxynucleoside triphosphate) sebagai
pembentuk basa komplementer dan penyusun DNA, terdiri atas 4 macam sesuai
dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP (Tarigan, 2011).
Primer atau disebut juga
dengan oglinukleotida (sepasang DNA utas tunggal pendek) merupakan suatu
fragmen yang terdiri atas 20-30 basa dan berkomplemen secara spesifik dengan
DNA cetakan. Syarat primer yang baik yaitu memiliki panjang basa oglinukleotida
18-24 basa, mempunyai urutan basa-basa spesifik untuk melekat pada DNA cetakan,
tidak terdapat basa-basa yang berkomplemen pada ujung 3’, komposisi basa guanin
(G) dan sitosin (C) adalah 50% dari seluruh basa, dan memiliki suhu melting yang tidak berbeda jauh
(Agustian, 2008). Primer berfungsi untuk menginisiasi sintesis DNA pada sekuens
target yang spesifik dan membatasi reaksi polimerisasi DNA (Tarigan, 2011).
Primer
terdiri dari dua macam, yaitu primer forward
dan primer reverse. Primer forward untuk menginisiasi sintesis
untai DNA dari ujung 5’ ke ujung 3’, sedangkan primer reverse menginisiasi sintesis DNA dari ujung 3’ ke ujung 5’. Kation
divalen terdiri dari ion logam bivalen (umumnya Mg2+) dan ion logam
monovalen (K+), berfungsi sebagai kofaktor bagi enzim DNA
polymerase. Tanpa ion-ion tersebut enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja
(Science biotech.net, 2011). DNA template adalah DNA yang memiliki sekuens
target untuk penempelan primer, berfungsi sebagai cetakan DNA yang akan diamplifikasi
(Agustian, 2008). Komponen yang terakhir yaitu enzim DNA polymerase berfungsi
untuk membaca kode DNA serta menghubungkan pasangan nukleotida dalam
menghasilkan salinan DNA (Sunarno, 2014).
Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular
berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada
suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan
dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA
yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).
Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA)
dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus
listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif melalui
membran matriks gel agarose (Yuwono, 2005).
Elektroforesis yang ada saat ini terdapat dua jenis yaitu,
elektroforesis horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Adapun
elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis horizontal karena
menggunakan gel agarose yang diletakkan pada alat elektroforesis secara
horizontal dan teknik ini difungsikan untuk analisis DNA.
Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama
proses berlangsung, sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dapat
disimpan dan didinginkan setelah percobaan, sehingga dapat dipakai untuk
dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu. Adapun
kekurangan dari metode ini yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan
campuran sampel ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil
(Boffey, 1984).
Teknik
elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 1%. Proses
pembuatan gel agarose 1% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarose
dengan larutan buffer TAE 1x yang kemudian dipanaskan di dalam microwave selama
30 detik, selanjutnya diberikan 1ul pewarna peq green (pada suhu 500C)
dan kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya
dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,25 gr
dan larutan running buffer TAE 1x (Trisasetat-EDTA) sebanyak 25 mL yang
berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan
kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam
ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan
running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan
pemanasan (Gardner, 1991).
Tahap
selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi
membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses
elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru
(Magdeldin, 2012).
Selanjutnya
dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 6µl dan
juga larutan marker sebanyak 6µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel.
Sedangkan untuk marker dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang
ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan
secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak melebihi batas
ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4)
sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).
Marker
adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker
berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi.
Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai
penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker
DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda
pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Marker
tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Martin,
1996).
Praktikum
dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus
listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 80
V dan dengan arus sebesar 400 mA selama 45 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat
dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan
bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin,
2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah
mengalami perubahan warna. Dokumentasi dilakukan dengan transluminator UV
(Davis dkk, 1994).
Berdasarkan
dari hasil di atas, terlihat bahwa terbentuk 14 pita DNA ladder pada Marker
(M). Bedasarkan pita tersebut, 3 pita DNA ladder dengan ukuran DNA sebesar 6000
bp, 3000 bp, dan 1000 bp lebih terlihat jika dibandingkan dengan pita DNA
ladder lainnya. Berdasarkan skala pada transluminator UV, jarak sampel terhadap
sumuran berada pada jarak 4 cm. Pada gambar di atas, hasil terlihat jelas pada
sampel 1b-4b. Sedangkan, pada sampel 5b dan 6b diperkirakan adanya kesalahan
dalam memasukkan sampel ke dalam sumuran. Kesalahan tersebut dapat berupa
tertusuknya gel agarosa saat pemauskan sampel (Handoyo, 2011).
Selanjutnya,
pada tahapan pemasukan sampel sebelum proses elektroforesis, pada sampel hasil
PCR (1a-6a dan 1b-6b) tidak diberikan campuran loading dye disebbakan pada
tahap PCR, sampel tersebut telah ditambahkan kit Instagene Matrix berupa 2x
Dream Taq Green RM + Dye. Kit ini kandungan yang terdapat di
dalamnya yaitu air dan polystyrene-divinylbenzene iminodiacetate (Biosciences,
1999).
Berdasarkan
hasil elektroforesis pada gambar 1, terlihat adanya pita yang terseparasi dan
sejajar dengan marker yang berukuran 1500 bp. Hal ini mengindikasikan bahwa
fragmen gen yang teramplifikasi memiliki ukuran kurang lebih 1500 bp. Hasil ini
sesuai dengan teori yang ada yaitu menyatakan bahwa molekul fragmen gen 16 S
RRNA bakteri memiliki ukuran 1500 bp, sehingga proses amplifikasi ini berhasil
dilakukan. Gen 16 S RRNA merupakan kerangka penyusun ribosom yang memiliki
peran yang sangat penting di dalam sinteisi protein dan dimiliki oleh semua sel
sehingga semua organisme dapat dibandingkan secara setara, selain itu gen ini
paling sering digunakan dalam mengidentifikasi bakteri (Biosciences, 1999).
Tabel
1. Jarak Migrasi DNA Ladder
Ukuran DNA (bp)
|
Jarak Migrasi (mm)
|
10000
|
23
|
8000
|
25
|
6000
|
27
|
5000
|
28
|
4000
|
30
|
3500
|
31
|
3000
|
33
|
2500
|
35
|
2000
|
38
|
1500
|
41
|
1000
|
45
|
750
|
48
|
500
|
52
|
250
|
Ket : Warna biru menunjukkan
jarak migrasi terdekat
Warna hijau menunjukkan jarak
migrasi terjauh
Gambar
2. Kurva Standar DNA Ladder
Berdasarkan
hasil di atas, terlihat bahwa jarak terdekat dari sumuran terdapat pada ukuran
DNA 10000 bp sebesar 23 mm dan jarak terjauh dari sumuran terdapat pada ukuran
DNA 500 bp sebesar 52 mm. Hasil pada tabel 1 ditunjukkan dengan kurva standar
DNA ladder pada gambar di atas. Kurva tersebut menunjukkan bahwa semakin besar
ukuran pita DNA ladder maka jarak migrasi akan semakin dekat dengan sumuran.
Kurva tersebut dibuat dengan tujuan sebagai acuan standar skala dalam
menentukan jarak pita sampel DNA terhadap DNA marker/ DNA ladder.
Tabel 2.
Hasil Uji Kuantitatif DNA dengan Sprektofotometer
Kelompok
|
Kode Sampel
|
Nilai Absorbansi (nm)
|
Kemurnian DNA
|
Konsentrasi DNA (µg/ml)
|
|
l = 260
|
l= 280
|
||||
1
|
Bc1
|
0.017
|
0.029
|
0.586
|
85
|
2
|
Bc2
|
0.005
|
0.012
|
0.417
|
25
|
3
|
Bc3
|
0.022
|
0.038
|
0.579
|
110
|
4
|
Ax4
|
0.007
|
0.023
|
0.304
|
35
|
5
|
Ax5
|
0.027
|
0.035
|
0.771
|
135
|
6
|
Ax6
|
0.019
|
0.027
|
0.704
|
95
|
Berdasakan pada praktikum uji
kuantitatif DNA digunakan sampel isolasi bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter
xylinum. Uji ini menggunakan bantuan alat spektrofotometer. Uji
kuantitatif merupakan metode analisis
untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut
mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Spektofotometer menghasilkan sinar dari
spektrum dengan panjang gelombang tertentu (Fatchiyah, 2012).
Kode Bc menunjukkan sampel
bakteri Bacillus cereus dan sampel Ax
menunjukkan sampel Acetobacter xylinum. Konsentrasi
dan nilai kemurnian DNA tertinggi pada masing-masing kelompok sampel (Bc dan
Ax), yakni terdapat pada sampel kelompok
3 dan pada sampel kelompok 5. Nilai yang dihasilkan pada sampel kelompok 3
sebesar 0,579 dan 110 µg/ml dan pada sampel kelompok 5 sebesar 0,771 dan 135
µg/ml. Nilai kemurnian dan konsentrasi DNA
pada sampel Bc dan Ax memiliki
nilai yang bervariasi. Nilai kemurnian berada pada kisaran 0,304-0,771
sedangkan nilai konsentrasi berada pada kisaran 25-135 µg/ml. Secara keseluruhan sampel, nilai kemurnian
DNA berada di bawah 1,8. Nilai kemurnian DNA berbanding lurus dengan nilai
konsentrasi DNA nya. Semakin tinggi nilai kemurnian DNA nya maka semakin tinggi
pula nilai konsentrasi DNAnya.
Uji
kuantitatif DNA merupakan analisis untuk mementukan kandungan atau jumlah DNA
yang terdapat di dalam suatu sampel. DNA dan RNA menyerap pada panjang
gelombang maksimal 260 nm, sementara protein menyerap kuat pada gelombang 180
nm. Selain itu, asam nukleat dapat menyerap secara signifikan pada panjang
gelombang 280 nm dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260 nm. Sehingga
untuk mengukur dengan akurat konsentrasi DNA, RNA, dan protein dalam suatu
campuran yang kompleks bukan hal yang mudah. Pengukuran absorbansi pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm dapat memberikan validasi kemurnian sampel asam
nukleat dengan nilai 1,8 untuk DNA dan 2,0 untuk RNA yang mengindikasikan
sampel murni. Nilai yang rendah akan menunjukkan adanya kontaminan lain atau
terdapatnya protein (Teare, 2009).
Absorbansi
spektrofotometri adalah teknik yang cepat dan akurat untuk menentukan
konsentrasi sampel DNA murni. Hal ini menjadi kurang akurat ketika sampel DNA
mengandung protein, RNA, oligonukleotida primer atau nukleotida. RNA, primer dan
nukleotida menyerap kuat pada 260 nm dan tidak bisa dibedakan dari DNA.
Kontaminan seperti protein dapat menyebabkan kelebihan isi DNA dalam sampel
campuran. Masalah ini dapat diatasi dengan menggunakan metode alternatif untuk
mengukur DNA saja dalam sampel dan dapat diatasi juga dengan menambahkan suatu
senyawa berfluoresensi, yaitu DNA quant 200. Metode pemurnian sampel
(DNA) juga dapat dilakukan secara kimiawi,
yaitu dengan cara merusak sel kemudian diberi buffer lisis yang berisi
senyawa kimia yang dapat merusak integritas barrier dinding sel, senyawa kimia
yang dipakai diantaranya lisosom, EDTA (etilen diamin, tetra asetat), Tris-CL
atau deterjen, SDS (sodium dosecycle sulphate) (Gardner, 1991).
Berdasarkan
hasil yang didapat dari analisis kuantitatif DNA bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter
xylinum dengan menggunakan alat spektrofotometer, nilai kemurnian DNA dari
kedua sampel bakteri tersebut tidak ada yang mendekati nilai 1,8 sehingga DNA
dapat dikatakan memiliki tingkat kemurnian DNA yang rendah. Hal ini menunjukkan
bahwa masih banyak terdapat pengotor fenol dan protein. DNA yang murni memiliki
rasio 1,8. Apabila nilai rasio lebih dari 1,8 menunjukkan adanya RNA, hal ini
karena RNA juga diserap pada panjang gelombang yang sama yaitu λ260 - λ280 nm.
Berdasarkan
nilai absorbansi pada l=260 nm
dari kedua DNA bakteri tersebut, dapat dikatakan DNA kromosomal kedua bakteri
yang diisolasi memiliki tingkat kemurnian yang rendah dan kurang bersih.
Menurut Restu, dkk (2012), secara teoritis sampel DNA yang dianggap cukup murni
memiliki perbandingan A260/A280 = 1,8-2,0. Tingkat kemurnian DNA yang rendah
dapat dimungkinkan terdapatnya kontaminasi fenol. Rasio OD 260/OD 280 < 1,8
menunjukkan adanya kontaminasi fenol atau protein hasil ekstraksi. Umumnya pemurnian DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol,
klorofom, dan isoamil alcohol yang berfungsi untuk menghilangkan senyawa
yang dapat mengkontaminasi DNA (Mulyani, 2011). Pemurnian DNA dengan penambahan
fenol dan kloroform berguna untuk mengendapkan protein dengan melalui proses
sentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan protease (Thermo
Scientific, 2009).
DNA
yang telah dibersihkan dari protein menggunakan fenol, masih bercampur dengan
RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA, karena
ekstraksel mengandung protein dan RNA disamping DNA dalam jumlah yang besar
(Thermo Scientific, 2009). Praktikum uji kuantitatif DNA tidak menggunakan
penambahan enzim RNAse sehingga kemungkinan masih banyaknya RNA yang terkandung
di dalam sampel, sehingga menyebabkan nilai kemurnian kedua DNA bakteri
tersebut kurang dari 1,8.
KESIMPULAN
Isolasi DNA bakteri 16S RNA menghasilkan 3 tabung sampel
ekstraksi dari bakteri Bacillus cereus
dan 3 tabung sampel dari Acebacter xylinum.
Tahap amplifikasi dengan PCR menghasilkan 12 tabung sampel dengan 2 macam
formula yang dibedakan berdasarkan komposisi volume dari DNA template serta
komposisi primer. Sementara pada tahap elektroforesis menghasilkan 14 pita DNA
ladder dan 4 pita sampel yang terlihat sejajar dengan pita Marker. Sementara
itu, pada hasil uji kuantitatif DNA disimpulkan bahwa tingkat kemurnian DNA
dari keseluruhan sampel adalah kurang bersih dan kurang murni karena
menunjukkan nilai <1,8.
SARAN
Praktikum harus dilakukan dengan
langkah-langkah yang tepat sesuai dengan yang diajarkan agar mendapatkan hasil
yang maksimal. Jumlah komposisi dan takaran bahan harus tepat untuk mendapatkan
hasil yang maksimal. Selain itu, DNA yang telah
diekstraksi perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel yang lain
agar DNA yang diperoleh memiliki nilai kemurnian yang tinggi. Selain itu, perlu
dilakukannya pemurnian kembali dan penambahan proteinase karena nilai kemurnian
DNA yang didapat masih menujukan angka <1,8.
DAFTAR PUSTAKA
Abinawanto, R. Lestari, A. Bowolaksono, M. Dian, D. P. Astuti &
H. Yasmin. 2011. Pedoman praktikum
genetika dasar. PT. Pandu Aksara, Jakarta Timur: iii + 77 hlm.
BIO-RAD. 2015. Safety Data Sheet. OSHA HCS.
BIO-RAD. 2015. Safety Data Sheet. OSHA HCS.
Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis.Amersham
Bioscience : USA.
Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field gel electrophoresis:
a practical guide. Academic Press, Inc., San Diego
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic
methods: Molecular biology 2nd ed. Appleton & Lange, Norwola
Fatchiyah, Arumingtyas Laras.
E, Widyarti Sri, dan Rahayu Sri. 2011. Biologi
Molekular Prinsip Dasar Analis.
Erlangga. Jakarta
Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad.
1991. Principles of genetics 8th ed. John Wiley &
Sons Inc., New York.
Handoyo, D. & R. Ari. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR 9: 17-28. Jean, Francois Giot.
2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal
of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction:
Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek
: Bogor.
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis -
Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka, Croatia.
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid
acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford.
Sunarno et
al. 2014. Metode Cepat Ekstraksi DNA
Corynebacterium diphtheria untuk Pemeriksaan
PCR. Departemen Mikrobiologi Klinik. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Suryo. 2004. Genetika.
Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain
Reaction Enzyme Linked Oligonucelotide
Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. WARTAZOA Vol.
21, No.1, Th.2011.
Teare, J.M. et al. 2009. Measurement of
Nucleic Acid Concentration Using the DyNa QuantTM and the
GenequantTM. BioTechniques. 1997;22(6):1170-1171.
Thermo Scientific. 2009. Thermo Scientific
Pierce Cell Lysis Technical Handbook : Featuring Cell Lysis Reagent and
Detergents Vol.
11, No.8
Tidak ada komentar:
Posting Komentar