PENGENALAN ALAT-ALAT ANALISIS MOLEKULAR
Fuzi Muchlissoh1), Muhammad Faiz 1),
Mutia Afifah1) Ratna Lestyana Dewi1) ,
Rizky Hastuti Purwaningsih1) Maulana Malik Assayiddin2), dan Puri Dwi
Nurmaulida 2)
1.
Mahasiswa
Program Studi Biologi
2.
Asisten
Dosen Praktikum Biologi Molekular Prodi Biologi
Program
Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas
Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
Abstrak
Biologi
molekular merupakan cabang ilmu biologi yang mengkaji mengenai kehidupan secara skala molekular. Pengenalan alat
merupakan langkah pertama sebelum melakukan praktikum atau penelitian. Tujuan
dari praktikum ini adalah mahasiswa dapat memahami prinsip kerja alat-alat yang
digunakan dalam praktikum biologi molekular, antara lain mikropipet,
sentrifugasi, spektrofotometer uv-vis (DNA/RNA calculator), elektroforesis horisontal, transluminator uv dan thermocyler (PCR machine) serta dapat mengoperasikan alat-alat tersebut dengan
benar. Praktikum
ini dilakukan pada hari Senin, 26 September 2016 pukul 08.00 – 10.30 WIB di laboratorium Fisiologi dan
Biologi Molekular Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) Universitas Islam Negeri
Syarif Hidayatullah Jakarta. Hasil yang
diperoleh yaitu terdapat beberapa alat-alat analisis molekular
seperti mikropipet, sentrifuga, spektrofotometer uv-vis (DNA/RNA calculator), elektroforesis horisontal,
transluminator uv dan thermocyler
(PCR machine). Alat-alat tersebut
merupakan alat utama yang digunakan dalam bidang molekular. Kesimpulannya adalah alat-alat
yang digunakan dalam praktikum biologi molekular mempunyai cara dan prinsip
kerja yang berbeda-beda. Selain itu juga dapat meminimalisir resiko kesalahan
kerja pada saat melakukan praktikum biologi molekular. Setiap pengguna harus
mengikuti hal-hal tersebut agar dalam menggunakan alat-alat laboratorium tidak
terjadi kerusakan alat ataupun hal-hal yang berbahaya.
Kata Kunci : DNA, elektroforesis, molekular
Abstract
Molecular
biology is a branch of the biological sciences study of the lives of molecular
in scale. The introduction of instrument is a first step prior to lab work or
research.The purpose of lab work this is a student can understand the principle
of the tools used in lab work molecular biology, among others micropipet,
centrifugation, of the spectrophotometer uv-vis (DNA/RNA calculator),
electrophoresis horizontal , transluminator uv and thermocyler (pcr machine) and can operate the
devices in truth. Lab work this started on monday , September 26th 2016 at 8 am - 10.30
a.m in the laboratory physiology and molecular biology center of laboratory
integrated (PLT) Syarif Hidayatullah State Islamic University of Jakarta. The
results are some tools molecular as micropipet analysis, these centrifuges, of
the spectrophotometer uv-vis (DNA/RNA calculator), electrophoresis horizontal,
transluminator uv and thermocyler (pcr machine) . Such tools are the main tool
used in the field of molecular. The conclusion is that the tools used in
molecular biology lab and working principles have a way different. It also
minimizes the risk of errors when performing work on the molecular biology lab.
Each user must follow these things in order in the use of laboratory equipment
no damage tools or things that are dangerous.
Keywords: DNA, electrophoresis, molecular
PENDAHULUAN
Biologi molekular merupakan cabang ilmu biologi yang mengkaji mengenai kehidupan secara skala molekular. Pengenalan alat
merupakan langkah pertama sebelum melakukan praktikum atau penelitian. Alat
adalah suatu pendukung dari keberhasilan suatu pekerjaan di laboraturium, untuk
memudahkan dan melancarkan keberlangsungan praktikum mengenai penggunaan alat
sangat diperlukan (John, 2011). Pengenalan alat dapat
memberitahukan berbagai macam alat-alat yang ada di laboratorium yang akan
digunakan. Setiap alat memiliki prinsip dan cara kerja yang berbeda-beda,
sehingga pengguna perlu mengetahui prosedur-prosedur dalam menjalankan suatu
alat di laboraturium agar tidak terjadi kerusakan atau hal lainnya. (John, 2011).
Mikropipet merupakan alat yang digunakan untuk
memindahkan cairan yang bervolume kecil yaitu <1000µl. terbagi menjadi dua tipe
yaitu adjustable volume pipette yaitu mikropipet yang volume pengambilannya
dapat diatur, yang memiliki kisaran antara 1 µl -20 µl, atau fixed volume
pipettemerupakan mikropipet yang volumenya tidak dapat diatur yang berukuran 5 µl (Khopkar, 1990).
Sentrifuga
merupakan alat yang dapat mengendapkan partikel dalam suatu larutan. Semakin
besar kekuatan sentrifugalnya maka semakin cepat pengendapannya. pengendapan
terjadi saat suatu sampel diberikan kecepatan tertentu dan hal ini bergantung
pada jari-jari dari sentrifugator (Cheesbrough, 2005).
Spektrofotometer UV-VIS
merupakan pengukuran panjang gelombang dan
intensitas sinar ultraviolet dan cahay tampak yang diabsorbsi oleh sampel
(Triyati, 1985). Digunakan juga sebagai pengukur tingkat kemurnian DNA hasil
isolasi. (Khopkar, 1990).
Elektroforesis merupakan suatu teknik untuk mengukur
laju perpindahan atau pergerakan partikel bermuatan dalam suatu medan listrik,
teknik ini menggunakan medium berbentuk gel yang dipengaruhi oleh faktor ukuran
partikel, komposisi dan konsentrasi gel, kuat medan listrik dan lain-lain.
Thermocycler atau PCR yaitu polymerase chain reaction yang merupakan alat
teknologi utama dalam bidang biologi molecular. PCR memiliki derajat spesifitas
dan sensivitas yang cukup tunggi, dengan waktu yang singkat dapat diperoleh
jutaan copy DNA (Cheesbrough, 2005).
Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa dapat
memahami prinsip kerja alat-alat yang digunakan dalam praktikum biologi
molekular, antara lain mikropipet, spektrofotometer uv-vis (DNA/RNA calculator), sentrifuga ,elektroforesis
horizontal, transluminator
uv dan thermocyler (PCR machine) serta dapat mengoperasikan
alat-alat tersebut dengan benar.
METODELOGI
Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilakukan pada hari
Senin taggal 26 September 2016 pukul 08.00 – 10.30 WIB. Praktikum ini dilakukan
di laboraturium Fisiologi dan Biologi Molekular Pusat Laboratorium Terpadu
(PLT) Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah mikropipet,
sentrifuga, spektrofotometer uv-vis, elektroforesis, transiluminator uv, dan
thermocycler. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah alat tulis.
Cara Kerja
Mikropipet
Pipet tip yang steril dipasangkan
pada ujung pipet, sebelum ujung tip dimasukkan ke larutan, tombol injector
ditekan sampai pada batas berhenti pertama. Kemudian ujung tip dimasukkan ke
dalam larutan kurang lebih 3 mm. Secara perlahan tombol injektor dilepas
kembali pada posisi bebas, sampai larutan terisap ke dalam tip. Kemudian, pipet
diangkat secara perlahan dari larutan, sehingga tidak ada tetesan larutan yang
tertinggal pada ujung tip. Ujung tip diposisikan pada dinding tabung atau
tempat dimana larutan akan dimasukkan dan diusahakan dinding tabung pada posisi
miring. Kemudian secara perlahan tombol injektor ditekan sampai pada batas
berhenti pertama, dan hentikan, setelah itu ditekan kembali sampai batas
berhenti kedua. Setelah itu tip diangkat dari tabung secara perlahan.
Selanjutnya, posisi tombol injektor dikembalikan pada posisi bebas dan tip
dilepaskan dari ujung mikropipet. Terakhir, volume mikropipet diatur pada
volume maksimal jika tidak digunakan dan diposisikan tegak pada rak mikropipet.
Sentrifuga
Sentrifuga disambungkan dengan
sumber listrik, kemudian dinyalakan dengan menekan tombol ON, tutup sentrifuga
dibuka dengan menekan tombol open lid .
kemudian tabung yang berisi sampel pada rotor alat sentrifuga disusun pada
posisi yang seimbang. Selanjutnya, sentrifuga ditutup dengan rapat, kemudian
diatur tombol kecepatan putaran yang diinginkan, tombol waktu, dan pengaturan
suhu. Setelah diatur, kemudian ditekan tombol start dan alat dibiarkan bekerja.
Setelah alat sentrifuga selesai, secara otomatis alat akan berhenti dan tutup
tidak boleh dibuka sebelum rotor benar-benar berhenti. Terakhir, tabung
dikeluarkan dan sentrifuga ditutup kembali.
Spektrofotometr
uv-vis
Alat disambungkan dengan sumber
listrik, kemudian dinyalakan dengan menekan tombol ON. Alat dibiarkan untuk
melakukan warming up selama kurang
lebih 15 menit atau tergantung jenis alatnya. Kemudian larutan blanko dalam
kuvet disiapkan, selanjutnya program untuk mengatur konsentrasi dan kemurnian
DNA/RNA diatur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemudian kuvet yang
berisi sampel dimasukkan, dan dibiarkan nilai absorbansi sampel terbaca oleh
alat. Jika pengukuran selesai, program dikembalikan ke menu awal. Terakhir alat
dimatikan juka tidak digunakan.
Elektroforesis
Horizontal
Gel agarosa disiapkan kemudian
dipasangkan pada tangki elektroforesis dengan posisi sumuran dekat dengan
elektroda negatif. Tangki diisi dengan running
buffer 1x, dapat berupa buffer TAE 1x atau TBE 1x hingga gel agarosa
terendam. DNA ladder serta sampel DNA
yang telah dicampur dengan loading dye
dimasukkan pada sumuran, dilakukan
dengan hati-hati jangan sampai gel agarosa bocor. Selanjutnya tangki
elektroforesis ditutup, kemudian disambungkan dengan power supply, dan diatur
dengan teganggan 100 volt, arus 400 mA, dan waktu running 45 menit atau sesuai
keperluan. Kemudian dibiarkan proses elektroforesis berjalan. Jika telah
selesai, power supply dimatikan dan tutup tangki dilepas. Selanjutnya gel
agarosa dikeluarkan, kemudian DNA dapat divisualisasikan di bawah sinar uv
dengan transiluminator uv. Terakhir tangki dibersihkan, dibilas dengan aquades,
dan dikeringkan dengan tisu.
Transiluminator
uv
Pertama-tama disambungkan dengan
sumber listrik kemudian dinyalakan dengan menekan tombol ON. Tutup
transiluminator uv dibuka, selanjutnya digunakan sarung tangan karet untuk
mengatur posisi gel agarosa diatas transiluminator uv dan ditutup kembali
penutup anti sinar uv. Digunakan kaca mata pelindung anti sinar uv, jika perlu
digunakan helm pelindung anti uv. Selanjutnya dinyalakan saklar lampu. Pita DNA
diamati kemudian didokumentasikan dengan kamera. Jika sudah selesailampu uv
dimatikan dan alat dimatikan. Terakhir gel agarosa dikeluarkan dan dibersihkan
dengan tisu basah.
Thermocycler
Alat disambungkan dengan sumber
listrik kemudian dinyalakan dengan menekan tombol ON. Alat dibiarkan melakukan
warming up selama kurang lebih 15 menit. Program untuk membuat protocol PCR
baru diatur atau protocol yang telah tersedia. Volume reaksi yang digunakan
diatur, selanjutnya dibuka penutup thermocycle dan disusun posisi tabung PCR,
dan ditutup kembali thermocycle dengan hati-hati. Tombol start ditekan untuk
menjalankan PCR, dan alat dibiarkan bekerja. Jika telah selesai, tabung PCR
dikeluarkan dan disimpan pada suhu 40C. Tampilan menu awal diatur
kembali dan biarkan alat mencapai suhu ruang lalu dimatikan.
HASIL
Berdasarkan pada hasil praktikum, maka diperoleh
data yang tertera pada tabel berikut :
Tabel
1. Alat-Alat Analisis Biologi Molekular
No.
|
Nama Alat
|
Fungsi
|
Prinsip Kerja
|
Gambar
|
1.
|
Mikropipet
|
Mengambil cairan dalam satuan mikroliter (mL)
|
Tekanan Thumb Knob, pada hambatan pertama (first stop)
membuat larutan di luar terhisap dan masuk ke dalam tip. Tekanan kedua (second
stop) membuat larutan yang berada di dalam tip keluar. Thumb Knob yang
diputar searah jarum jam dan dibantu sedikit penekanan akan mendorong tip
keluar dari mikropipet, sehingga tip akan terlepas.
|
(Sumber: Dok. Pribadi, 2016)
|
2.
|
Sentrifuga
|
Fraksinasi beberapa komponen berdasarkan berat molekulnya
|
Memanfaatkan gaya sentrifugal, yaitu gaya yang timbul
akibat benda yang diputar dari satu titik sebagai porosnya untuk memisahkan
partikel dari satu benda cair atau memisahkan benda cair dari kepadatan yang
berbeda .
Kecepatan rotor 0-3.000 rpm, menampung 5-100 ml sampel
|
(Sumber: Internet, 2016)
|
3.
|
Refrigerated Microsentrifuge
|
Fraksinasi beberapa komponen berdasarkan berat molekul dan
dilengkapi sistem pendingin untuk menjaga sampel agar tetap dingin
|
Memanfaatkan gaya sentrifugal, rotor berkecepatan tinggi
(0-20.000 rpm), untuk volume microtube berkisar 0,5 – 2 ml, dan
menggunakan suhu yang rendah
|
Sumber: Dok. Pribadi,
2016)
|
4.
|
Tabung Mikro (Blue Tube Volume 15 mL)
|
Sebagai wadah sampel/cairan
|
Memanfaatkan putaran rotor dari sentrifuga
|
(Sumber: Dok. Pribadi, 2016)
|
5.
|
Tabung Mikro (Microtube)
Volume 5 mL
|
Sebagai wadah sampel/cairan
|
Memanfaatkan putaran rotor dari mikro sentrifuga
|
(Sumber: Dok. Pribadi, 2016)
|
6.
|
Spektrofotometer uv-vis
|
Mengukur nilai absorbansi larutan
|
Memanfaatkan kisaran panjang gelombang dan cahaya tampak.
Cahaya diteruskan àDibaca dan dikonversi oleh detektor à
muncul nilai atau angka pada reader
|
(Sumber: Dok. Pribadi, 2016)
|
7.
|
Kuvet
|
Wadah larutan blanko dan sampel
|
Memanfaatkan penyerapan sinar ultra violet
Sinar uv àditeruskan menembus cuvet à
terbaca oleh detektor
|
(Sumber: Dok. Pribadi, 2016)
|
8.
|
Elektroforesis
horizontal
|
Memvisualisasikan
protein atau materi genetik
|
Migrasi
partikel bermuatan di bawah pengaruh arus listrik
|
(Sumber
:Dok.Pribadi, 2016)
|
9.
|
Transiluminator
UV
|
Memvisualisasikan
hasil pergerakan DNA/RNA pada gel hasil elektroforesis dengan menggunakan
sinar UV
|
Visualisasi
atau pengamatan pita DNA yang tampak melalui bantuan sinar ultraviolet
|
(Sumber : Dok.
Pribadi, 2016)
|
10.
|
Thermocycler
(PCR machine)
|
Menjalankan
proses amplifikasi DNA
|
Amplifikasi
atau perbanyakan nukleotida melalui proses enzimatik yang dilakukan secara in
vitro
|
(Sumber : Dok.Pribadi, 2016)
|
PEMBAHASAN
Pengenalan
alat-alat analisis molekular sangat penting agar dapat memahami prinsip kerja
dari alat-alat yang digunakan terkait dalam melakukan praktikum dan
menganalisis data-data molekular. (Mayangsari, 2012).
Mikropipet
merupakan alat yang berfungsi untuk memindahkan cairan dalam jumlah kecil
secara akurat. Sedangkan jenis pipet lainnya, seperti pipet ukur dan pipet
gondok tidak mempunyai akurasi yang tinggi untuk volume cairan kurang dari 1 ml.
Mikropipet yang digunakan dalam praktikum biologi molekular adalah mikropipet single
channel, yaitu mikropipet yang hanya dapat menghisap satu jenis cairan
dalam satu kali isapan. Mikropipet dilengkapi dengan tip berbagai ukuran yang
disesuaikan dengan jenis mikropipet. Tip biru (Blue tip), digunakan
untuk mengambil cairan dengan kisaran volume 100-1000 ml. Tip kuning (Yellow
tip), memiliki kisaran volume 10-200 ml, dan tip putih (White
tip), memiliki kisaran volume 0,2-10 ml. (Khopkar,1990).
Prinsip
kerja dari mikropipet ini adalah tekanan dari Thumb Knob. Tekanan Thumb Knob
pada hambatan pertama (first stop) membuat larutan di luar terhisap dan
masuk ke dalam tip. Tekanan kedua (second stop) membuat larutan yang
berada di dalam tip keluar. Thumb Knob yang diputar searah jarum jam dan
dibantu sedikit penekanan akan mendorong tip keluar dari mikropipet, sehingga
tip akan terlepas. Hal ini dikarenakan gaya dorong (gaya tekan) di dalam tip
lebih besar dibandingkan di luar tip. Selain itu, perbedaan pengambilan larutan
dengan Thumb Knob juga disepengaruhi oleh tingkat viskositas (kekentalan) dari
suatu larutan (Mahardika, 2005).
Sentrifuga
dapat mengendapkan partikel-pertikel dalam sebuah larutan. Alat ini sering
digunakan dalam fraksinasi beberapa komponen berdasarkan berat molekulnya. Alat
ini juga dilengkapi oleh tabung sentrifuga dengan beberapa variasi ukuran,
antara lain tabung mikro 1,5 ml, 15 ml, 50 ml, dan sebagainya. Kecepatan
putaran rotor sentrifuga dinyatakan dalam satuan revolution per minute
(x g) atau relative centrifugal force (rcf). Semakin besar kekuatan
sentrifugalnya maka pengendapannya menjadi semakin cepat dan efektif.
Terjadinya pengendapan bergantung pada kecepatan dari jari-jari dan
sentrifugatornya. Kemudian, terdapat dua tipe baling-baling sentrifuga, yaitu fixed-angle dan swing
out. Pemisahan partikel pada tipe fixed-angle terjadi lebih cepat
karena kekuatan sentrifugal yang besar dibandingkan tipe baling-baling swing
out. Tipe baling-baling swing out memiliki tabung yang berukuran
panjang. Pada saat penggunaannya, panjang tabung tersebut tidak boleh melebihi
panjang jari-jari sentrifugator karena dapat terjadi kerusakan saat alat
dinyalakan (Cheesbrough, 2005).
Spektrofotometer
uv-vis berfungsi untuk mengukur nilai absorbansi suatu larutan pada kisaran
panjang gelombang sinar ultra violet dan cahaya tampak. Prinsip kerjanya, yakni
apabila cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh pada suatu medium homogen
maka sebagian dari sinar yang masuk akan dipantulkan, sebagian diserap dalam
medium itu, dan sisanya akan diteruskan. Detektor atau pembaca cahaya dari
sampel akan mengkonversi data sinar menjadi nilai atau angka yang akan
ditampilkan pada reader (Triyati, 1995).
Adapun
nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi
karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel. Untuk mengukur konsentrasi
dan kemurnian DNA panjang gelombang yang dibituhkan adalah 260 nm dan 280 nm,
sehingga alat ini disebut juga sebagai DNA/ RNA kalkulator. Saat menutup tempat
kuvet, hindarkan dari adanya cahaya yang masuk ke dalam alat karena apabila ada
cahaya lain maka secara otomatis jumlah cahaya yang diukur menjadi bertambah. Alat ini dilengkapi dengan dua lampu dengan panjang gelombang
berbeda, yakni lampu Wolfram untuk sinar visible (380- 780 nm) dan lampu
deuteium untuk sinar ultra violet (180-380 nm). Spektrofotometer uv-vis juga
dilengkapi dengan kuvet berbagai ukuran sebagai wadah larutan blanko dan sampel
(Triyati, 1995).
Kuvet berfungsi sebagai tempat larutan
yang diukur absorbansi atau transmitannya. Kuvet yang digunakan pada daeah
ultraviolet menggunakan kuvet yang terbuat dari kuarsa atau kaca silika,
sedangkan daerah tampak terbuat dari kaca. Pada umumnya tebal kuvet adalah
10 mm, tetapi juga ada ukuran yang lebih kecil dan lebih
besar yang dapat digunakan. Kuvet yang biasa
digunakan berbentuk persegi, tetapi ada juga yang berbentuk
silinder (Mayangsari, 2012).
Kemudian, alat selanjutnya ialah
elektroforesis yang merupakan suatu teknik pemisahan molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Alat ini
menggunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan partikel pada medium gel
tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan
konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan
sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau
migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks
berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui
matriks tersebut (Mayangsari, 2012).
Asam nukleat laju migrasinya berbanding
terbalik dengan ukuran molekulnya. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di
dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif.
Semakin besar ukuran molekulnya, semakin rendah laju migrasinya.
Semakin tinggi konsentrasi media semakin lambat kecepatan DNA, sedangkan jika
arus dinaikan maka semakin cepat pergerakan DNA (John, 2011).
Transiluminator UV adalah alat yang
digunakan untuk memvisualisasikan DNA setelah proses elektroforesis. Alat ini
umum dalam laboratorium yang bekerja dengan aspek biologi molekular. Prinsip
kerja transilumnator UV adalah sinar UV dipancarkan dan akan memendarkan
Ethidium bromide (EtBr) yang membuat khelat dengan molekul DNA, sehingga DNA dapat
dilihat oleh mata manusia (Yuwono, 2006).
Alat molekular selanjutnya adalah thermocycler yang
merupakan alat yang berfungsi untuk menjalankan proses amplifikasi DNA atau
Polymerase Chain Reaction (PCR). Amplifikasi DNA pada PCR dapat dicapai bila
menggunakan primer oligonukleotida yang disebut amplimers. Primer DNA suatu
sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA.
PCR memungkinkan akan
dilakukannya
pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Umumnya primer yang digunakan pada PCR terdiri
dari 20-30 nukleotida. DNA template (cetakan) yaitu fragmen DNA yang akan
dilipatgandakan dan berasal dari patogen yang terdapat dalam spesimen klinik.
Enzim DNA polimerase merupakan enzim termostabil Taq dari bakteri termofilik
Thermus aquaticus. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) menempel pada ujung 3’
primer ketika proses pemanjangan dan ion magnesium menstimulasi aktivasi polymerase
(Yuwono,
2006).
Pada
proses PCR menggunakan menggunakan alat termosiklus. Sebuah mesin yang memiliki
kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan mengatur
temperatur untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR
yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat, yaitu
denaturasi, annealing, dan extension (Mordechai, 1999).
Denaturasi awal dilakukan sebelum
enzim taq polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA
merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini
biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA
terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap
mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara
cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang
terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim
tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing
pada suhu 92,5; 95 dan 97,5˚C (Mordechai, 1999).
Saat proses annealing (penempelan), pengenalan
(annealing) suatu primer terhadap DNA target tergantung pada panjang untai,
banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu sendiri. Optimalisasi pada temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting
Temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA template. Pada umumnya
temperatur annealing biasanya 5ºC ddibawah Tm primer yang sebenarnya. Secara
praktis, Tm ini dipengaruhi oleh komponen buffer, konsentrasi primer dan DNA
template (Mordechai, 1999).
Kemudian tahapan berlanjut ke proses extension.
Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer
dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu
72˚C diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH,
konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR
dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk
tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang
digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk
PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda. Reaksi-reaksi tersebut di atas
diulangi lagi dari 25 – 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan
diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil
polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA
cetakan yang digunakan. (Mordechai, 1999).
Banyaknya siklus amplifikasi tergantung
pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi. Produk PCR dapat
diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa.
Metode ini terdiri atas menginjeksi DNA ke dalam gel agarosa dan menyatukan gel
tersebut dengan listrik. Hasilnya untai DNA kecil pindah dengan cepat dan untai
yang besar diantara gel menunjukkan hasil positif. (Khopkar, 1990).
Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi.
Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Spesifitas PCR
terletak pada kemampuannya mengamplifikasi sehingga menghasilkan produk melalui
sejumlah siklus. Keakuratan yang tinggi karena DNA polymerase mampu menghindari
kesalahan pada amplifikasi produk.
KESIMPULAN
Alat-alat
praktikum biologi molekular adalah mikropipet, sentrifugasi, spektrofotometer
uv-vis (DNA/RNA calculator),
elektroforesis horisontal, elektroforesis vertikal, transluminator uv dan thermocyler (PCR machine). Alat-alat tersebut merupakan alat utama yang digunakan
dalam bidang molekular. Alat-alat laboratorium mempunyai
cara dan prinsip kerja yang berbeda-beda. Selain itu juga dapat meminimalisir
resiko kesalahan kerja pada saat melakukan praktikum biologi molekular. Setiap
pengguna harus mengikuti hal-hal tersebut agar dalam menggunakan alat-alat
laboratorium tidak terjadi kerusakan alat ataupun hal-hal yang berbahaya
(Mordechai, 1999).
SARAN
Saat melakukan
suatu kegiatan yang berhubungan dengan molekular khususnya dalam praktikum
biologi molekular, praktikan harus sangat memperhatikan alat-alat apa yang
harus dipakai untuk melakukan suatu kegiatan karena alat-alat tersebut memiliki
prinsip kerja dan fungsi yang berbeda-beda, begitu pula dalam hal pemeliharaan
(maintenance) alat-alat
tersebut.
DAFTAR PUSTAKA
Cheesbrough, Monica. 2005. District
Laboratory
Parctice in Tropical
Countries,ed.Vol.2.Cambridge.
Cambridge University Press
John dan Rachmawati. 2011. Chemistry
3A Universitas.
Erlangga.
Jakarta
Khopkar,
S. M. 1990. Konsep Dasar
Kimia Analitik.
UI-Press. Jakarta
Mahardika, I.G. Ngurah K. 2005.
Polymerase
Chain Reaction. Jurnal Veteriner Vol.4 No. 1. Bali.
Mayangsari, Yunika. 2012.
Electrophoresis.Fakultas
Teknologi Agrikultural UGM:
Yogyakarta
Mordechai, E., 1999. Application of PCR
The
methodologies in Molecular
Diagnostic. Burlington Country, USA.
Triyati, Etty. 1995. Spektrofotometer
Ultra-Violet
dan Sinar Tampak
Serta
Aplikasinya dalam Oseanologi. Oseana. Vol. 10. No 1: 39-7. Universitas Airlangga
Yuwono dan Tribowo, 2006. Teori dan
Aplikasi Polymerase Chain Reaction,
Panduan Eksperimen PCR untuk Memecahkan Masalah Biologi Terkini, Penerbit Andi,
Yogyakarta.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar