UJI KUANTITATIF DNA BAKTERI

UJI KUANTITATIF DNA BAKTERI

Rr. Bhintarti Suryo Hastari, M. Biomed¹⁾ Maulana Malik Assayiddin²⁾, Puri Dwi Nurmaulida ²⁾,  Fuzi Muchlissoh³⁾, Muhammad Faiz³⁾, Mutia Afifah³⁾, Ratna Lestyana D.³⁾ , Rizky Hastuti P.³

¹⁾Dosen Praktikum Biologi Molekular; ²⁾Asisten Dosen Praktikum Biologi Molekular; ³⁾Praktikan

Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Abstrak

                                                                                                                                                                 

Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan dengan uji kualitatif. Metode ini menggunakan bantuan alat spektrofotometer. Sampel ekstraksi dibagi ke dalam enam kelompok. Kelompok 1-3 adalah sampel Bacillus cereus (Bc 1,2,dan 3) dan kelompok 4-6 adalah Acetobacter xyulinum (Ax 4,5, dan 6). Nilai kemurnian DNA berada pada kisaran 0,304-0,771 sedangkan nilai konsentrasi berada pada kisaran 25-135 µg/ml.  Secara keseluruhan sampel, nilai kemurnian DNA berada di bawah 1,8, sehingga dapat dikatakan bahwa sampel DNA kurang murni dan kurang bersih.

Kata kunci : Bakteri, DNA, purifikasi

Abstract

Quantitative DNA test is an analysis to determine the content or the amount of DNA present in a substance or substances which components have previously been shown the presence of DNA plasmids in the solution with the qualitative test. This method uses the aid of a spectrophotometer. Sample extraction was divided into six groups. 1-3 is a sample group of Bacillus cereus (Bc 1,2, and 3) and the group 4-6 is Acetobacter xyulinum (AX 4.5, and 6). DNA purity value in the range of 0.304 to 0.771, while the concentration in the range of 25-135 pg / ml. Overall samples, DNA purity values ​​were under 1.8, so it can be said that the DNA sample is less pure and less clean.

Key words: Bacteria, DNA, purification

---

PENDAHULUAN

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun organel, yaitu mitokondria dan kloroplas. Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain, yaitu preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstraksi sel dan presipitasi DNA. Tahapan untuk mengekstrak DNA, diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti, yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel lain. Pada saat melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang (Fatchiyah et al. 2012).

Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA (Zubaidah, 2004).

Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan dengan uji kualitatif. DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein atau fenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini maka kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280, dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah et al. 2011).

Menurut Muhammad, S. A., dan Praseno (1991), rasio yang kurang dari 1,8 menunjukan bahwa preparasi DNA telah terkontaminasi baik oleh fenol maupun protein. Sedangkan rasio yang dengan nilai di atas dua (> 2)  berarti bahwa preparasi DNA telah terkontaminasi oleh RNA. Oleh karena itu, praktikum ini bertujuan untuk mengetahui kemurnian dari suatu DNA dalam larutan sampel melalui teknik uji kuantitatif DNA dengan alat spektrofotometer UV-Vis

MATERIAL DAN METODE

Praktikum ini dilakukan pada hari Senin, 28 November 2016 pada pukul 08.00–10.00 WIB yang bertempat di PLT (Pusat Laboratorium Terpadu) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Sampel ekstraksi dibagi ke dalam enam kelompok. Kelompok 1-3 adalah sampel Bacillus cereus (Bc 1,2,dan 3) dan kelompok 4-6 adalah Acetobacter xyulinum (Ax 4,5, dan 6).

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah spektrofotometer, mikropipet, tip, vortex, mikrotube, sentrifuge, dan kuvet. Sedangkan bahan yang digunakan adalah sampel ekstraksi DNA bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum dan akuabides.

Cara kerjanya, yakni pertama, hasil ekstraksi dithowing terlebih dahulu untuk memastikan sampel sudah tidak terlalu dingin, kemudian divortex selama 10 detik. Lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit. Selanjutnya, sampel yang akan digunakan konsentrasinya diencerkan hingga 100x (10 µl sampel DNA dan 990 µl akuabides), sampel yang telah diecerkan lalu dimasukkan pada mikrotube baru dan divortex selama 10 detik. Disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit. Setelah itu dipindahkan ke dalam kuvet dan diukur nilai absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm di spektrofotometer UV-Vis.

HASIL

Hasil yang didapat berupa kemurnian DNA dan konsentrasi DNA. Hasil uji kuantitatif terhadap DNA yang diisolasi dapat dilihat pada tabel 1. di bawah ini.

Tabel 1. Hasil Uji Kuantitatif DNA dengan Sprektofotometer

Kelompok	Kode Sampel	Nilai Absorbansi (nm)		Kemurnian DNA	Konsentrasi DNA (µg/ml)
		l = 260	l= 280
1	Bc1	0.017	0.029	0.586	85
2	Bc2	0.005	0.012	0.417	25
3	Bc3	0.022	0.038	0.579	110
4	Ax4	0.007	0.023	0.304	35
5	Ax5	0.027	0.035	0.771	135
6	Ax6	0.019	0.027	0.704	95

Kode Bc menunjukkan sampel bakteri Bacillus cereus dan sampel Ax menunjukkan sampel Acetobacter xylinum. Konsentrasi dan nilai kemurnian DNA tertinggi pada masing-masing kelompok sampel (Bc dan Ax), yakni terdapat pada  sampel kelompok 3 dan pada sampel kelompok 5. Nilai yang dihasilkan pada sampel kelompok 3 sebesar 0,579 dan 110 µg/ml dan pada sampel kelompok 5 sebesar 0,771 dan 135 µg/ml. Nilai kemurnian dan konsentrasi DNA  pada sampel Bc dan  Ax memiliki nilai yang bervariasi. Nilai kemurnian berada pada kisaran 0,304-0,771 sedangkan nilai konsentrasi berada pada kisaran 25-135 µg/ml.  Secara keseluruhan sampel, nilai kemurnian DNA berada di bawah 1,8. Nilai kemurnian DNA berbanding lurus dengan nilai konsentrasi DNA nya. Semakin tinggi nilai kemurnian DNA nya maka semakin tinggi pula nilai konsentrasi DNA nya.

PEMBAHASAN

Praktikum uji kuantitatif DNA digunakan sampel isolasi bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum. Uji ini menggunakan bantuan alat spektrofotometer. Uji kuantitatif  merupakan metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Spektofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu (Fatchiyah, dkk. 2012).

            Uji kuantitatif DNA merupakan analisis untuk mementukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat di dalam suatu sampel. DNA dan RNA menyerap pada panjang gelombang maksimal 260 nm, sementara protein menyerap kuat pada gelombang 180 nm. Selain itu, asam nukleat dapat menyerap secara signifikan pada panjang gelombang 280 nm dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260 nm. Sehingga untuk mengukur dengan akurat konsentrasi DNA, RNA, dan protein dalam suatu campuran yang kompleks bukan hal yang mudah. Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dapat memberikan validasi kemurnian sampel asam nukleat dengan nilai 1,8 untuk DNA dan 2,0 untuk RNA yang mengindikasikan sampel murni. Nilai yang rendah akan menunjukkan adanya kontaminan lain atau terdapatnya protein (Teare, 2009).

            Absorbansi spektrofotometri adalah teknik yang cepat dan akurat untuk menentukan konsentrasi sampel DNA murni. Hal ini menjadi kurang akurat ketika sampel DNA mengandung protein, RNA, oligonukleotida primer atau nukleotida. RNA, primer dan nukleotida menyerap kuat pada 260 nm dan tidak bisa dibedakan dari DNA. Kontaminan seperti protein dapat menyebabkan kelebihan isi DNA dalam sampel campuran. Masalah ini dapat diatasi dengan menggunakan metode alternatif untuk mengukur DNA saja dalam sampel dan dapat diatasi juga dengan menambahkan suatu senyawa  berfluoresensi, yaitu DNA quant 200. Metode pemurnian sampel (DNA) juga dapat dilakukan secara kimiawi,  yaitu dengan cara merusak sel kemudian diberi buffer lisis yang berisi senyawa kimia yang dapat merusak integritas barrier dinding sel, senyawa kimia yang dipakai diantaranya lisosom, EDTA (etilen diamin, tetra asetat), Tris-CL atau deterjen, SDS (sodium dosecycle sulphate).

            Berdasarkan hasil yang didapat dari analisis kuantitatif DNA bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum dengan menggunakan alat spektrofotometer, nilai kemurnian DNA dari kedua sampel bakteri tersebut tidak ada yang mendekati nilai 1,8 sehingga DNA dapat dikatakan memiliki tingkat kemurnian DNA yang rendah. Hal ini menunjukkan bahwa masih banyak terdapat pengotor fenol dan protein. DNA yang murni memiliki rasio 1,8. Apabila nilai rasio lebih dari 1,8 menunjukkan adanya RNA, hal ini karena RNA juga diserap pada panjang gelombang yang sama yaitu λ260 - λ280 nm.

            Berdasarkan nilai absorbansi pada l=260 nm dari kedua DNA bakteri tersebut, dapat dikatakan DNA kromosomal kedua bakteri yang diisolasi memiliki tingkat kemurnian yang rendah dan kurang bersih. Menurut Restu, dkk (2012), secara teoritis sampel DNA yang dianggap cukup murni memiliki perbandingan A260/A280 = 1,8-2,0. Tingkat kemurnian DNA yang rendah dapat dimungkinkan terdapatnya kontaminasi fenol. Rasio OD 260/OD 280 < 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi fenol atau protein hasil ekstraksi (Devereu dan Wilkinson, 2004).  Umumnya pemurnian DNA  dilakukan dengan penambahan larutan fenol, klorofom, dan isoamil alcohol yang berfungsi untuk menghilangkan senyawa yang dapat mengkontaminasi DNA (Mulyani, 2011). Pemurnian DNA dengan penambahan fenol dan kloroform berguna untuk mengendapkan protein dengan melalui proses sentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan protease (Thermo Scientific, 2009).

            DNA yang telah dibersihkan dari protein menggunakan fenol, masih bercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA, karena ekstraksel mengandung protein dan RNA disamping DNA dalam jumlah yang besar (Thermo Scientific, 2009). Praktikum uji kuantitatif DNA tidak menggunakan penambahan enzim RNAse sehingga kemungkinan masih banyaknya RNA yang terkandung di dalam sampel, sehingga menyebabkan nilai kemurnian kedua DNA bakteri tersebut kurang dari 1,8.

KESIMPULAN

            Berdasarkan hasil uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometer UV-Vis maka dapat disimpulkan bahwa tingkat kemurnian DNA dari keseluruhan sampel adalah kurang bersih dan kurang murni karena menunjukkan nilai di bawah 1,8.

SARAN

            DNA yang telah diekstraksi perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel yang lain agar DNA yang diperoleh memiliki nilai kemurnian yang tinggi. Selain itu, perlu dilakukannya pemurnian kembali dan penambahan proteinase karena nilai kemurnian DNA yang didapat masih menujukan angka kurang dari 1,8.

DAFTAR PUSTAKA

Devereux, R. & S.S. Wilkinson. 2004. Amplification of Ribosomal RNA Sequance. Kluwer Academic Publiser. Netherlands

Fatchiyah, et al. 2012. Buku Praktikum Teknik Analisa Biologi Molekuler. Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Brawijaya. Malang.

Muhammad, S. A., dan Praseno. 1991. Pengantar Kloning Gen. Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta. Hal 31-33.

Mulyani , Yuniar. Purwanto, Agus, dan . Nurruhwati, Isni. 20011. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk Deteksi Koi Herpes Virus (KHV) pada Ikan Mas (Cyprinus carpio L.). Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjajaran Jatinangor. Bandung.

Restu, Muh., Mukrimin, dan Gusmiaty. 2012. Optimasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi Tanaman Suren (Toona sureni Merr.) untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Jurnal Natur Indonesia 14(2) : 138-142.

Teare, J.M. et al. 2009. Measurement of Nucleic Acid Concentration Using the DyNa QuantTM and the GenequantTM. BioTechniques. 1997;22(6):1170-1171.

Thermo Sience. 2009. Thermo Scientific Pierce Cell Lysis Technical Handbook : Featuring Cell Lysis Reagent and Detergents, Ver. 2