ISOLASI DNA KROMOSOMAL BAKTERI

ISOLASI DNA KROMOSOMAL BAKTERI

drh. Rr. Bhintarti Suryo Hastari, M. Biomed¹⁾ Maulana Malik Assayiddin²⁾, Puri Dwi Nurmaulida ²⁾ Fuzi Muchlissoh³⁾, Muhammad Faiz ³⁾, Mutia Afifah³⁾ Ratna Lestyana Dewi³⁾ , Rizky Hastuti Purwaningsih³⁾

¹⁾Mahasiswa Program Studi Biologi Dosen Praktikum Biologi Molekular Prodi Biologi

²⁾ Asisten Dosen Praktikum Biologi Molekular Prodi Biologi

³⁾ Mahasiswa Program Studi Biologi

Program Studi Biologi

Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Abstrak

Perkembangan ilmu biologi molekuler yang semakin maju memicu adanya rasa penasaran untuk mempelajari materi genetik (gen) penyusun dari suatu makhluk hidup. Tubuh makhluk hidup tersusun dari beberapa organel, salah satunya ribosom. Tujuan praktikum ini untuk dapat mengisolasi DNA pengkode gen 16S rRNA dari bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum, mengamplifikasi DNA tersebut  dengan metode PCR, serta dapat mengidentifikasi fragmen DNA tersebut dengan menggunakan elektroforesis horisontal gel agarosa. Metode dalam praktikum ini yaitu preparasi sampel, isolasi DNA, amplifikasi, dan elektroforesis horizontal gel agarosa. isolasi DNA bakteri 16S RNA menghasilkan 3 tabung sampel ekstraksi dari bakteri Bacillus cereus dan 3 tabung sampel dari Acebacter xylinum. Pada tahap amplifikasi dengan PCR, dihasilkan 12 tabung sampel dengan 2 macam formula yang dibedakan berdasarkan komposisi volume dari DNA template serta komposisi primer. Pada tahapan elektroforesis dihasilkan 14 pita DNA ladder dan 4 pita sampel yang terlihat sejajar dengan pita Marker.

Kata kunci: DNA, elektroforesis, isolasi, PCR

Abstract

The development of molecular biology more advanced trigger their curiosity for the review study of genetic material (genes) constituent of a living. Living body composed from several organelles, praying only ribosomes. Singer laboratory objectives for the review can be isolated DNA encoding 16S rRNA genes from bacteria Bacillus cereus and Acetobacter xylinum, amplify the DNA by PCR method, as well as DNA fragments can be identified using the with horizontal agarose gel electrophoresis. Namely hearts methods practicum singer sample preparation, DNA isolation, amplification, and agarose gel electrophoresis horizontal. DNA isolation bacteria 16S rRNA extraction sample tubes produce 3 from the bacteria Bacillus cereus and 3 sample tubes from Acebacter xylinum. On the PCR amplification stage, produced 12 kinds of sample tubes with two the differentiated formula based on the composition volume from DNA templates as well as the primary composition. Based on stages produced 14 DNA electrophoresis ladder and four tape samples in parallel with visible marker tape.

Keywords: DNA, electrophoresis, isolation, PCR

================================================================================

PENDAHULUAN

Perkembangan ilmu biologi molekuler yang semakin maju memicu adanya rasa penasaran untuk mempelajari materi genetik (gen) penyusun dari suatu makhluk hidup. Tubuh makhluk hidup tersusun dari beberapa organel, salah satunya ribosom. Ribosom tersusun atas molekul sub unit besar dan molekul sub unit kecil. Mikroorganisme prokariotik seperti bakteri tersusun atas 50S dan 30S. Sub unit 50S berisi dua rRNA (23S dan 5S) kompleks dengan 34 protein dan subunit 30S rRNA 16S mengandung kompleks dengan 21 protein (Campbell,  et al, 2008).

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia paling penting pada makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo, 2004). Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk Genom. Genom  meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. Bakteri termasuk organisme pokariotik yang memiliki DNA berbentuk sirkular dan terletak di dalam sitoplasma (Jusuf, 2001). Isolasi DNA merupakan langkah untuk mempelajari DNA. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain, seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam  isolasi DNA ada tiga, yakni penghancuran (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan  padat, seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Fatchiyah, et al, 2011).

Tahap lanjutan dari isolasi DNA adalah amplifikasi DNA dengan Polymerse Chain Reaction (PCR). Hal tersebut bermanfaat dalam memperbanyak jumlah DNA agar dapat dimanfaatkan lebih maksimal karena jumlahnya lebih banyak. Hasil dari PCR dapat dilihat menggunakan elektroforesis gel untuk mengetahui visualisasi dari tahapan-tahapan di atas dan  mengetahui berat molekul dari pita DNA target. Oleh karena itu, praktikum ini bertujuan untuk dapat mengisolasi DNA pengkode gen 16S rRNA dari bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum, mengamplifikasi DNA tersebut  dengan metode PCR, serta dapat mengidentifikasi fragmen DNA tersebut dengan menggunakan elektroforesis horisontal gel agarosa.

METODE

a.      Lokasi dan Waktu

Praktikum ini dilakukan pada tanggal  7, 14, dan 21 November 2016 di Laboratorium Fisiologi dan Laboratorium Mikrobiologi, Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

b.      Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah biakan koloni bakteri cair Bacillus cereus dan Asetobakter silinum, H₂O, instagene matriks,  gen Rrna 16S, primer 27 F  dan 1492 R, dream taq green 2x master mix + dye, nuclease free water, peq green, buffer TAE 1x, marker, loading dye, dan gel agarose 1%.

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah mikro tube, sentrifuge, mikropipet, water bath, vortex, thermocycler, tangki elektroforesis, transluminator UV, Erlenmeyer, sisir, microwave, dan kamera.

c.       Langkah Kerja

Preparasi DNA Bakteri dengan Instagene Matriks

Biakan koloni cair bakteri Bacillus cereus dan Asetobakter silinum diresuspensi dalam 1 ml di dalam H₂O, selanjutnya di sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Kemudian seupernatan dibuang dengan menggunakan mikropipet. Pellet ditambahkan 100µl instagene matriks strirrer moderated speed. Selanjutnya diinkubasi di dalam water bath dengan suhu 56⁰C selama 30 menit, kemudian di vortex selama 10 detik, dan diinkubasi kembali dengan suhu 100⁰C selama 8 menit. Kemudian di vortex selama 10 detik, di sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit. Kemudian super natan dipindahkan ke dalam tabung baru dan disimpan dalam suhu 4⁰C.

PCR Gen 16S rRNA

Isolat bakteri Bacillus cereus dan Asetobakter silinum yang ada di microtube, masing-masing dibagi menjadi 2 tipe yaitu a untuk Asetobakter silinum dan b untuk Bacillus cereus. Tipe a di masukkan formula 2x dream taq green RM+dye sebanyak 12,5 µl menggunakan micropipette, kemudian ditambahkan DNA template sebanyak 10 µl, 10 µM primer 27F sebanyak 1,25 µl, 10 µM primer 1492 R sebanyak 1,25 µl setelah itu, sampel dihomogenkan menggunakan vortex dalam waktu 5 detik. Tipe b dimasukkan formula 2x dream taq green RM+dye sebanyak 12,5 µl menggunakan micropipette, kemudian ditambahkan DNA template sebanyak 1 µl, 10 µM primer 27F sebanyak 0,5 µl, 10 µM primer 1492 R sebanayak 0,5 µl, dan nuclease free water sebanyak 10,5 µl, setelah itu dihomogenkan  menggunakan vortex dalam waktu 5 detik. Selanjutnya, PCR di set dengan suhu pre-denaturasi 95⁰ C selama 5 menit, denaturasi 95⁰C selama30 detik, anneling 51⁰ C selama 30 detik, ektension 72⁰ C selama 2 menit, final ekstension 72 ⁰C selama 10 menit, dan stop pada suhu 4⁰ C. Microtube disusun di dalam Thermocycler pada bagian tengah, dan ditekan tombol start dan didiamkan hingga proses selesai.

Elektroforesis Gel Agarose

Pembuatan gel dengan memasukkan gel agarose 1% sebanyak 0,25 gram dan 25 ml buffer TAE 1x ke dalam Erlenmeyer, selanjutnya dimasukkan ke dalam microwave selama 30 menit, dimasukkan peq green sebanyak 1 µl pada saat gel agarose bersuhu 50⁰C yang kemudian dihomogenkan. Selanjutnya gel agarose yang sudah homogen dimasukkan ke dalam cetakan dengan posisi yang seimbang. Sebelum meletakkan gel agarose di dalam cetakan, diletakkan sisir terlebih dahulu pada urutan 8 dan 15, setelah itu baru gel agarose dituang ke dalamnya. Gel agarose akan berubah menjadi warna keabu-abuan jika sudah megeras. Selanjutnya gel agarose dimasukkan pada chamber. Produk PCR b dimasukkan pada sisir B dengan menggunakan mikropipet. Pemasukkan sampel dilakukan dari sisi kiri menuju sisi kanan. Formula marker terdiri dari 1 µl marker ditambah 1 µl loading dye, dan 4 µl air, sedangkan formulasi ekstraksi sampel sebanyak 5 µl ditambah 1 µl loading dye. Sampel dimasukkan pada cetakan gel agarose sesuai formasi yang telah ditentukan. Running elektroforesis dengan panjang gelombang 80v, tegangan 400mA selama 45 menit.

Transluminator UV

Hasil running pada elektroforesis divisualisasikan menggunakan sinar UV pada transluminator. Gel agarose diletakkan di atas transluminator uv, selanjutnya ditutup dengan penutup anti sinar uv. Digunakan kaca mata pelindung anti sinar uv, selanjutnya dinyalakan saklar lampu uv dan diamati pita DNA yang tampak dan didokumentasikan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA dapat ditemukan di kromosom inti maupun di organel (Fatchiyah, 2011). Prinsip utama dalam isolasi DNA yaitu sentrifugasi dan presipitasi.

Praktikum ini menggunakan bakteri Bacillus cereus dan Asetobakter silinum yang kemudian diisolasi DNA-nya. Isolasi DNA bakteri digunakan dream taq green 2x master mix atau yang disebut sebagai instagene matriks, merupakan sebuah kit yang sudah diproduksi secara konvensional yang berfungsi untuk mempercepat proses isolasi DNA. Kandungan yang terdapat di dalamnya yaitu air dan polystyrene-divinylbenzene iminodiacetate (Bio-Rad, 2015).

Isolasi DNA memiliki prinsip untuk memisahkan DNA kromosom atau atau DNA genom dari komponen sel yang lain. Setelah kultur disentrifugasi didapat endapan putih yaitu berupa supernatant. Prinsip utama dari sentrifugasi yaitu memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul, sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar. Prinsip dari presipitasi yaitu pengendapan DNA agar terpisah dari zat lain yang terdapat di sel (Kimball, 2005).

Isolasi DNA bakteri menggunakan metode boiling dengan melakukan pemanasan suhu tinggi selama beberapa menit yang menyebabkan peningkatan permeabilitas dinding sel yang berakibat masuknya cairan dan materi lain di sekitar sel dan keluarnya materi dari dalam sel. Suhu tinggi berfungsi untuk inaktifasi enzim, terutama DNA-ase yang dapat merusak DNA. Suhu yang digunakan dalam pemanasan tergantung pada sampel yang digunakan. Ekstraksi DNA dengan metode boiling mudah untuk dilakukan karena hanya membutuhkan waktu yang tidak terlalu lama, namun kualitas yang dihasilkan relative lebih rendah dibandingkan dengan metode lain (Sunarno et al, 2014).

Polymerase chain reaction (PCR) merupakan salah satu teknik yang paling penting dalam biologi molekuler. Teknik tersebut bertujuan untuk memperbanyak DNA secara in vitro dalam suatu reaksi termal. Metode PCR telah banyak berperan dalam pengembangan bidang biologi molekuler khususnya genetika. Beberapa aplikasi metode PCR diantaranya human genome project, diagnosis penyakit genetik, analisis filogenetik dan lain-lain.

Teknik PCR merupakan suatu metode enzimatik untuk memperbanyak (amplifikasi) DNA secara in vitro (ekstraselular) (MSU 2008:1). Prinsip kerja PCR (Polymerase Chain Reaction) yaitu  menggunakan reaction mixture  serta memanfaatkan enzim dari  DNA polymerase  yang bersifat termostabil dan fragmen DNA yang pendek disebut primer. Primer berfungsi untuk mensintesis secara langsung sekuens DNA target spesifik dari DNA template. Reaksi sintesis tersebut terus berulang sehingga membentuk suatu siklus. Produk dari siklus sintesis sebelumnya dapat berfungsi sebagai template atau cetakan bagi siklus selanjutnya. Hasilnya ialah amplifikasi eksponensial dari sekuens DNA target. Siklus yang berulang tersebut dapat berlangsung karena penggunaan Taq polymerase. Taq polymerase ialah sebuah enzim polymerase bersifat termostabil yang diisolasi dari bakteri termofilik yaitu Thermus aquaticus (MSU 2008:1).

Komponen – komponen dalam reaction mixture PCR yaitu H₂O steril, fungsinya sebagai pelarut campuran. Bufer berfungsi untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. Bufer biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia. Komponen lainnya yaitu dNTP (deoxynucleoside triphosphate) sebagai pembentuk basa komplementer dan penyusun DNA, terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP (MSU 2008: 2). Primer berfungsi untuk menginisiasi sintesis DNA pada sekuens target yang spesifik dan membatasi reaksi polimerisasi DNA. Primer terdiri dari dua macam, yaitu primer forward dan primer reverse. Primer forward untuk menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 5’ ke ujung 3’, sedangkan primer reverse menginisiasi sintesis DNA dari ujung 3’ ke ujung 5’. Kation divalen terdiri dari ion logam bivalen (umumnya Mg²⁺) dan ion logam monovalen (K⁺), berfungsi sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion-ion tersebut enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja (Science biotech.net , 2011) DNA template adalah DNA yang memiliki sekuens target untuk penempelan primer, berfungsi sebagai cetakan DNA yang akan diamplifikasi (Agustian, 2008). Komponen yang terakhir yaitu enzim DNA polymerase berfungsi untuk membaca kode DNA serta menghubungkan pasangan nukleotida dalam menghasilkan salinan DNA (The university of Utah 2008).

Primer atau disebut juga dengan oglinukleotida (sepasang DNA utas tunggal pendek) merupakan suatu fragmen yang terdiri atas 20-30 basa dan basa-basa tersebut akan berkomplemen secara spesifik dengan DNA cetakan. Primer dirancang dengan memiliki sekuens yang komplemen dengan DNA template sehingga dapat mengapit daerah tertentu yang diinginkan. Syarat primer yang baik antara lain memiliki panjang basa oglinukleotida antara 18-24 basa, mempunyai urutan basa-basa spesifik untuk melekat pada DNA cetakan, tidak terdapat basa-basa yang berkomplemen pada ujung 3’ yang menyebabkan terjadinya dimer, komposisi basa guanin (G) dan sitosin (C) adalah 50% dari seluruh basa, dan dua primer yang dipasangkan memiliki suhu melting yang tidak berbeda jauh (Agustian, 2008). Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap yaitu denaturasi, annealing, dan polimerisasi. Denaturasi berlangsung pada suhu 94^o C selama 30 detik. Pada tahap denaturasi, reaksi enzimatik berhenti dan ikatan hidrogen terputus sehingga DNA untai ganda berpisah menjadi DNA untai tunggal. Annealing berlangsung pada suhu  55^o C selama 3 detik. Pada tahap tersebut primer akan  menempel pada DNA template di tempat yang berkomplemen dengan sekuens primer. Tahap terakhir yaitu polimerisasi berlangsung selama 30 detik pada suhu 72^o C merupakan proses pemanjangan primer menggunakan untai tunggal DNA sebagai cetakannya. DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai dengan pasangannya (Agustian, 2008).

Cara mendesain suhu dan waktu pada setiap tahap siklus PCR ialah dengan mengatur CYCL program pada mesin thermal cycler. Pada menu utama, ditekan tombol option dan dipilih create lalu enter. Kemudian ditekan tombol option dan dipilih CYCL lalu tekan enter. Tentukan angka setpoints satu sampai tiga. Dimasukkan suhu dan waktu sesuai dengan yang diinginkan. Ditekan enter untuk mengkonfirmasi nilai yang telah dimasukkan. Selanjutnya, ditentukan jumlah siklus dengan menekan enter a new value. Mesin thermal cycler akan running sesuai dengan kondisi yang telah diatur. Jumlah siklus PCR ditentukan oleh rumus 2n dengan n adalah banyaknya jumlah siklus (Labequip, 2006).

Suhu penempelan atau annealing ditentukan berdasarkan primer yang digunakan serta dipengaruhi oleh komposisi dan panjang primer. Suhu penempelan yang baik berkisar 5^o C dibawah suhu leleh atau melting temperature (Tm). Suhu leleh (Tm) dapat dihitung dengan menggunakan rumus :

Tm = 4(G+C) + 2(A+T) ^oC

Keterangan :
Tm = melting temperature
(G+C) = jumlah guanin dan sitosin pada oglinukleotida
(A+T) = jumlah adenin dan timin pada oglinukleotida (Abinawanto dkk. 2011: 47).

Mesin thermal cycler merupakan mesin yang dapat diprogram untuk menaikkan dan  menurunkan suhu sesuai dengan urutan waktu dan suhu yang diinginkan, dalam hal ini mengatur siklus annealing, elongasi, dan denaturasi pada saat amplifikasi DNA berlangsung (UNAIR 2011: 1). Kontrol positif diperlukan untuk memudahkan pemecahan masalah apabila terjadi hal yang tidak diinginkan. Selain itu, kontrol positif juga diperlukan untuk memverifikasi hasil amplifikasi negatif dan reaksi kontrol positif harus mengandung komponen yang sama dengan sampel. Kontrol negatif dibutuhkan untuk menghindari kesalahan positif semu seperti terjadinya kontaminasi atau reaksi amplifikasi non spesifik (Handoyo & Ari 2001: 28).

Amplifikasi DNA dengan metode PCR memiliki kelebihan dan kekurangan jika dibandingkan dengan teknik lain. Adapun kelebihan metode PCR adalah dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Selain itu reaksi amplifikasi sangat spesifik dan akurat serta mudah dilakukan secara otomatis. Kekurangan metode PCR adalah dibutuhkan banyak biaya untuk memperbanyak DNA, campuran yang digunakan rentan terhadap kontaminasi, dan metode PCR tidak bisa mengekspresikan mutasi genetik (Handoyo & Ari 2001: 20).

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).

Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005).

            Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Adapun elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk analisais DNA.

            Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses berlangsung, sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan, metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran sampel ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984).

            Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 1%.  Proses pembuatan gel agarose 1% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarose dengan larutan buffer TAE 1x yang kemudian dipanaskan di dalam microwave selama 30 detik, selanjutnya diberikan 1ul pewarna peq green (pada suhu 50⁰C) dan kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras.  Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,25 gr dan larutan running buffer TAE 1x (Trisasetat-EDTA) sebanyak 25 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner dkk, 1991). 

            Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin, 2012).

            Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 6µl dan juga larutan marker sebanyak 6µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel. Sedangkan untuk marker dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak melebihi batas ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO₄) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).

            Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi.  Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi.  Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII.  Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993; Martin, 1996).

            Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 80 V dan dengan arus sebesar 400 mA selama 45 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna.  Dokumentasi dilakukan dengan transluminator UV (Davis dkk, 1994).

            Berdasarkan pada proses elektoforesis, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1.        Ukuran Molekul DNA

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.

2.        Konsentrasi gel

Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA.  Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3.        Bentuk molekul

Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.

4.        Densitas muatan

Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul.  Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.

5.        Pori-pori gel

Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6.        Voltase

Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7.        Larutan buffer elektroforesis

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA (Wolfe, 1993).

Gambar 1. Pola Pita Elektroforesis DNA Kromosomal Isolat  Bakteri

           

Berdasarkan dari hasil di atas, terlihat bahwa terbentuk 14 pita DNA ladder pada Marker (M). Bedasarkan pita tersebut, 3 pita DNA ladder dengan ukuran DNA sebesar 6000 bp, 3000 bp, dan 1000 bp lebih terlihat jika dibandingkan dengan pita DNA ladder lainnya. Berdasarkan skala pada transluminator UV, jarak sampel terhadap sumuran berada pada jarak 4 cm. Pada gambar di atas, hasil terlihat jelas pada sampel 1b-4b. Sedangkan, pada sampel 5b dan 6b diperkirakan adanya kesalahan dalam memasukkan sampel ke dalam sumuran. Kesalahan tersebut dapat berupa tertusuknya gel agarosa saat pemauskan sampel.

Pada tahapan pemasukan sampel sebelum proses elektroforesis, pada sampel hasil PCR (1a-6a dan 1b-6b) tidak diberikan campuran loading dye disebbakan pada tahap PCR, sampel tersebut telah ditambahkan kit Instagene Matrix berupa 2x Dream Taq Green RM + Dye. Kit ini kandungan yang terdapat di dalamnya yaitu air dan polystyrene-divinylbenzene iminodiacetate (Bio-Rad, 2015).

Tabel 1. Jarak Migrasi DNA Ladder

Ukuran DNA (bp)	Jarak Migrasi (mm)
10000	23
8000	25
6000	27
5000	28
4000	30
3500	31
3000	33
2500	35
2000	38
1500	41
1000	45
750	48
500	52
250

Gambar 2. Kurva Standar DNA Ladder

Berdasarkan hasil di atas, terlihat bahwa jarak terdekat dari sumuran terdapat pada ukuran DNA 10000 bp sebesar 23 mm dan jarak terjauh dari sumuran terdapat pada ukuran DNA 500 bp sebesar 52 mm. Hasil pada tabel 1 ditunjukkan dengan kurva standar DNA ladder pada gambar di atas. Kurva tersebut menunjukkan bahwa semakin besar ukuran pita DNA ladder maka jarak migrasi akan semakin dekat dengan sumuran. Kurva tersebut dibuat dengan tujuan sebagai acuan standar skala dalam menentukan jarak pita sampel DNA terhadap DNA marker/ DNA ladder.

KESIMPULAN

            Berdasarkan hasil praktikum di atas, dapat disimpulkan bahwa isolasi DNA bakteri 16S RNA menghasilkan 3 tabung sampel ekstraksi dari bakteri Bacillus cereus dan 3 tabung sampel dari Acebacter xylinum. Pada tahap amplifikasi dengan PCR, dihasilkan 12 tabung sampel dengan 2 macam formula yang dibedakan berdasarkan komposisi volume dari DNA template serta komposisi primer. Pada tahapan elektroforesis dihasilkan 14 pita DNA ladder dan 4 pita sampel yang terlihat sejajar dengan pita Marker.

SARAN

            Praktikum harus dilakukan dengan langkah-langkah yang tepat sesuai dengan yang diajarkan agar mendapatkan hasil yang maksimal. Jumlah komposisi dan takaran bahan harus tepat untuk mendapatkan hasil yang maksimal dan sesuai dengan yang diharapkan. Pengunaan alat dan cara pemakaiannya harus benar dan sesuai dengan instruksi agar mengurangi persentase kegagalan praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

Abinawanto, R. Lestari, A. Bowolaksono, M. Dian, D. P. Astuti & H. Yasmin. 2011. Pedoman praktikum genetika dasar. PT. Pandu Aksara, Jakarta Timur: iii + 77 hlm.
BIO-RAD. 2015. Safety Data Sheet. OSHA HCS.

Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis.Amersham Biosciences : USA.

Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field gel electrophoresis: a practical guide. Academic Press, Inc., San Diego.

Boffey, S. A. (1984). Isolation of high molecular weight DNA, in Methods in Molecular     Biology, vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana, Totowa, NJ.

Campbell, N.A. Jane B. reece dan Lawrence G. Mitchell. 2008. Biologi edisi 8 , Jilid 1. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga : Jakarta.

Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2^nd ed. Appleton &      Lange, Norwola.

Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole Publishing Company, New York.

Fatchiyah, Arumingtyas Laras. E, Widyarti Sri, dan Rahayu Sri. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analis. Erlangga. Jakarta

Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8^th ed. John Wiley        & Sons Inc., New York.

Handoyo, D. & R. Ari. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction            (PCR). PCR 9: 17-28. Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).

Jusuf, M. 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Penerbit Sagung Seto. Bogor. Kimball. J. 2005.Biologi. ed. ke -5. jilid 1. terj dari Biology. 5th ed, oleh Prof. DR. Ir. H. Siti    Soetarmi T. Erlangga. Jakarta: xiii + 333 hlm.

Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4^th ed. Merrill Publishing Co. :      Columbus, Ohio.

Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis     in agarose gel electrophoresis.Tropical Biomedicine 27(2): 351-354 (2010).

Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek : Bogor.

Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka, Croatia.

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford.

Russell, P. J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College Publishers, New York.

Sunarno et al. 2014. Metode Cepat Ekstraksi DNA Corynebacterium diphtheria untuk        Pemeriksaan PCR. Departemen Mikrobiologi Klinik. Fakultas Kedokteran Universitas    Indonesia.

Suryo. 2004.  Genetika. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked   Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011.

Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company, Belmont.