ISOLASI PROTEIN DAN ANALISIS PROFIL PITA PROTEIN DENGAN METODE LOWRY DAN SDS-PAGE

ISOLASI PROTEIN DAN ANALISIS PROFIL PITA PROTEIN DENGAN METODE LOWRY DAN SDS-PAGE

drh. Rr. Bhintarti Suryo Hastari, M. Biomed¹⁾ Maulana Malik Assayiddin²⁾, Puri Dwi Nurmaulida ²⁾,  Fuzi Muchlissoh³⁾, Muhammad Faiz³⁾, Mutia Afifah³⁾, Ratna Lestyana D.³⁾ , Rizky Hastuti P.³

¹⁾Dosen Praktikum Biologi Molekular; ²⁾Asisten Dosen Praktikum Biologi Molekular; ³⁾Praktikan

Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Abstrak

Protein adalah biomakromolekul polipeptida yang tersusun dari sejumlah L-asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Praktikum ini bertujuan untuk dapat melakukan isolasi protein, menentukan kadar protein pada sampel tertentu, dapat menganalisis masing-masing profil pita protein dari tiap sampel dan mengetahui nilai mobilitas relatif (Rf). Sampel protein dibagi ke dalam 6 kelompok (S₁,S₂, S₃, S₄, U₁, dan S₆). Isolasi dan penetapan kadar protein dengan metode Lowry dan analisis profil pita protein melalui teknik SDS-PAGE pada gel poliakrilamid 12,5% terhadap sampel A₄. Larutan standar yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) pada panjang gelombang (l) 774 nm. Hasil persamaan linear kurva standar adalah y= 0,0018x + 0,0097 dengan nilai R = 0,9887. Kadar protein pada sampel S₁ (41,63%), S₂ (39,35%), S₃ (16,92%), S₄ (0,55%), U₁ (-1,66%), dan S₆ (0,98%). Pita protein pada sampel A₄ dengan BM 45 kDa memperlihatkan intensitas warna yang paling jelas dan paling tebal, sehingga dapat digunakan sebagai acuan bagi sampel yang memiliki BM di bawah 45 kDa. Pita-pita protein dengan BM di bawah 45 kDa berada pada urutan ke-1 sampai ke-3 dari bawah. Berdasarkan keadaan tersebut maka diperoleh lima pita yang digunakan untuk menentukan BM protein pada tiap sampel. Nilai Rf dari sampel A₄ berada pada kisaran 0,06-0,44 yang menunjukkan bahwa hasil pemisahan protein berlangsung baik.

Kata kunci : Kadar protein, Metode Lowry, Profil protein, SDS-PAGE

Abstract

Protein is the polipeptide biomacromolecule consists of  some L-amino acid which connected by peptide bind. This observation is aimed to get the protein isolation, deciding the protein amount on specific sample, analyzing each profile of protein bands from each samples and knowing the relative mobility value (Rf). The protein sample is divided into 6th groups (S₁,S₂, S₃, S₄, U₁, dan S₆). The isolation of protein amount with Lowry method and analyze of protein band profile by SDS-Page technique on 12,5% poliacrilamide gel on A₄ sample. The 774 nm Bovine Serum Albumin (BSA) is used as standard solution. The result of standard curve linear equation is y= 0,0018x + 0,0097 with R = 0,9887. The amount of protein from S₁ sample is (41,63%), S₂ (39,35%), S₃ (16,92%), S₄ (0,55%), U₁ (-1,66%), dan S₆ (0,98%). The protein band form A₄ sample with molecul mass of 45 kDa showing the clearest and the thickest of color intensity, so it can be used as control for the sample which have molecul mass <45 kDa. The bands of protein <45 kDa is on 1st to 3rd rate from below. Based on this condition, five bands for deciding the molecul mass of protein form each samples has been gotten. The Rf value on A₄ sample is around 0,06-0,44 shows that protein separating process goin well.

Key words: Lowry method, Protein content, Protein profile, SDS-PAGE

---

PENDAHULUAN

Protein adalah biomakromolekul polipeptida yang tersusun dari sejumlah L-asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida, berbobot molekul tinggi dari 5.000 sampai berjuta-juta. Protein terdiri dari bermacam-macam golongan makro molekul yang heterogen namun semuanya merupakan turunan dari polipeptida dengan Berat molekul (BM) yang tinggi.  Unsur yang ada pada hampir semua protein adalah Hidrogen, Oksigen, Nitrogen, dan Belerang.

Ditinjau dari strukturnya, protein dibagi ke dalam dua golongan besar, yaitu golongan protein sederhana dan protein gabungan. Protein sederhana adalah protein yang hanya terdiri dari molekul-molekul asam amino, sedangkan protein gabungan adalah protein yang terdiri dari protein dan gugus bukan protein. 

Pemisahan molekul protein dari makromolekul yang lain atau pemisahan protein dari sifat tertentu dari prosedur lainnya memerlukan prosedur isolasi protein. Tahap awal isolasi dapat menggunakan pengendapan dengan garam ammonium sulfat yang dipengaruhi faktor jumlah dan posisi gugus polar, BM, pH serta suhu larutan (Poedjiadi,2007). Protein yang telah diperoleh dari teknik isolasi selanjutnya dapat dianalisis secara kualitatif maupun kuantitatif. Beberapa metode yang biasa digunakan, yaitu metode Biuret, Lowry, dan sebagainya.

Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret dan membutuhkan pereaksi lain, yakni Folin-Ciocalteauphenol yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein sehingga dihasilkan warna kebiruan yang dapat dibaca oleh spektrofotometer uv-vis pada panjang gelombang 500-750 nm, tergantung tingkat sensitivitas yang dibutuhkan (Soeharsono,2006).

Analisis SDS-PAGE merupakan prosedur dasar dalam banyak aplikasi analisis protein. Poliakrilamida dapat memisahkan protein dengan kisaran Berat Molekul 500 - 250.000 atau polinukleotida dengan kisaran 5-2.000 pasang basa (bp) (Hermansyah,2012).

Oleh karena itu, praktikum ini bertujuan untuk dapat melakukan isolasi protein, menentukan kadar protein pada sampel tertentu dan dapat menganalisis masing-masing profil pita protein dari tiap sampel dan mengetahui nilai mobilitas relatif (Rf).

MATERIAL DAN METODE

Praktikum ini dilakukan pada tanggal 10-17 Oktober 2016 di Laboratorium Fisiologi dan Laboratorium Pangan, Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah sampel protein, BSA 200 ppm, pereaksi A CuSO₄ 1%, pereaksi B Na₂CO₃ 2%, folin, dan larutan kalibrasi 10, 20, 40, 80, 160 ppm, gel poliakrilamid-SDS 10%, buffer sampel, buffer elektroda (10x), larutan pewarna (Coomassie Brilliant Blue R-250), larutan pencuci, isobutanol, penanda berat molekul broadrange (Biorad) 200 kDa, β-merkaptoetanol dan agar nobel 2%.

Alat-alat yang digunakan dalam adalah mikrotube, spektrofotometer UV-Vis, peralatan elektroforesis, pipet tetes, pipet volumetrik, mikropipet dan mikrotip, sarung tangan, erlenmeyer, parafilm, klem, vortex, penangas air, sentrifus mikro dan power supply.

Isolasi Protein dan Pengukuran Kadar Protein (Metode Lowry)

Kadar protein dalam sampel protein diukur dengan menggunakan metode Lowry. Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan dengan 5 ml campuran pereaksi A (20 mM CuSO₄.5H₂O dan 30 mM Na-sitrat) dan pereaksi B (0,1 M Na2CO3 dan 0,1 M NaOH). Campuran reaksi dihomogenkan dengan vortex dan didiamkan 10 menit. Selanjutnya 0,5 ml larutan D (reagan Folin ciocalteu 1 N) ditambahkan ke dalam campuran reaksi kemudian dihomogenkan dengan vortex dan didiamkan selama 30 menit.

Kadar protein ditentukan dengan bantuan kurva standar BSA. Variasi konsentrasi BSA dalam kurva standar mencakup konsentrasi protein dalam sampel ekstrak protein. Variasi serial konsentrasi yang digunakan dalam kurva standar adalah 0, 10, 20, 40, 80, dan 160 ppm dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 774 nm. Penentuan kadar protein dalam suatu sampel ekstrak protein dilakukan dengan menggunakan persamaan regresi linier yang diperoleh dari grafik pada larutan standar.

Analisis Profil Pita Protein melalui Teknik SDS-PAGE

Persiapan Sampel

Sampel buffer dimasukkan ke dalam sampel protein (1:1) dalam tabung Eppendorf. Sampel dipanaskan pada suhu 100˚C selama 5 menit. Jika sampel tidak langsung digunakan maka disimpan terlebih dahulu pada suhu 20˚C.

Persiapan Separating Gel dan Stacking Gel

Tabung propilen 50 ml disiapkan terlebih dahulu. Setelah itu, dimasukkan stok akrilamid sebanyak 3,125 ml, 2,75 ml 1M Tris pH 8,8, akuabides 1,505 ml (tabung ditutup dan digoyang perlahan), 75µl SDS-10% (tabung ditutup dan digoyang perlahan), 75 µl APS (tabung ditutup dan digoyang perlahan), dan 6,25 µl TEMED (tabung ditutup dan digoyang perlahan).

Larutan dituang ke dalam plate pembentuk gel dengan menggunakan 1 ml sampai batas yang tertera pada plate. Setelah itu ditambahkan akuades di atas larutan gel dalam plate. Gel dibiarkan memadat kurang lebih 30 menit. Setelah itu air yang menutupi separating gel dibuang. Kemudian pembuatan stacking gel 3%, prosesnya sama dengan pembuatan separating gel, akan tetapi yang membedakan adalah volume larutannya ( bis-akrilamida 30% 0,45 ml, 1 M Tris pH 6,8 0,38 ml, aquabides 2,11 µl, SDS 10% 30 µl, TEMED 5 µl, dan APS 10% 30 µl.

Pemasukan Sampel

Plate yang berisi gel dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis. Setelah itu, running buffer dituang sampai bagian atas dan bawah terendam. Gelembung udara pada dasar gel atau di antara sumur sampel dihilangkan. Sebanyak 10-20 µl sampel dimasukkan ke dalam sumuran dengan syringe Hamilton. Syringe dibilas sebanyak tiga kali dengan running buffer sebelum digunakan untuk memasukkan sampel yang berbeda pada sumur gel berikutnya.

Running Sampel

Perangkat elektroforesis dihubungkan dengan sumber listrik. Setelah itu, running dikondisikan pada arus konstan 120 Volt selama kurang lebih 120 menit sampai tracking dye mencapai jarak 0,5 cm dari dasar gel. Kemudian running buffer dituang dan gel diambil dari plate.

Pewarnaan Gel dengan Coomasie Brilliant Blue

Larutan staining disiapkan untuk mewarnai protein pada gel dan larutan destaining untuk menghilangkan warna pada gel serta memperjelas pita protein. Setelah itu gel direndam pada 20 ml staining solution sambil digoyang ± 15 menit. Lalu larutan staining dituang kembali pada wadahnya. Setelah itu, dicuci dengan air beberapa kali lalu gel direndam dalam 50 ml larutan destaining sambil digoyang ± 30 menit atau sampai pita protein terlihat jelas.

HASIL

Konsentrasi yang digunakan dalam kurva standar adalah dari 0 sampai 160 mg/ml dengan variasi konsentrasi 0, 10, 20, 40, 80, dan 160 mg/ml dan diperoleh nilai absorbansi hasil analisis kadar protein pada kurva standar (Tabel 1). Absobansi standar berada pada panjang gelombang (l) 774 nm (Gambar 1).

Tabel 1. Nilai absorbansi konsentrasi larutan BSA (sebagai standar)

Konsentrasi (mg/ml)	Nilai l pada 774 nm
0	0
10	0,016
20	0,053
40	0,088
80	0,192
160	0,297

Tabel 2. Nilai absorbansi sampel, Persamaan kurva standar = y = 0,001894x + 0,009717

Sampel	Absorbansi Sampel (Y)	Y = 0,001894x + 0,009717	FP (103)	mg/mLxFP (x)	Kadar Protein (mg/g)	Kadar Protein (% g/g)
S1	0,174	86,7386	24	2.081.726,4	416,34	41,63
S2	0,165	81,9868	24	1.967.683,2	393,53	39,35
S3	0,170	84,6267	10	846.267	169,25	16,92
S4	0,015	2,7893	10	27.893	5,57	0,55
U1	-0,006*	-8,2983*	10	-82.983*	-16,60*	-1,66*
S6	0,019	4,9013	10	49.013	9,80	0,98

Hasil dari perhitungan pada tabel larutan standar dibuat kurva linear dengan nilai konsentrasi sebagai sumbu-x dan nilai absorbansi sebagai sumbu-y. Kurva absorbansi standar BSA pada Gambar 1., membentuk puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar di sekitar 770 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah.

Hasil pengukuran konsentrasi kontrol an-absorbansi standar dimasukkan ke dalam persamaan linear sehingga diperoleh kurva standar protein. Berdasarkan perhitungan tersebut maka diperoleh persamaan linear y= 0,0018x + 0,0097. Kurva dari persamaan linear tersebut memperlihatkan slop positif dengan kontrol garis yang mendekati 1, yaitu nilai R = 0,9887 (Gambar 2).

Hasil pengukuran absorbansi dari keenam sampel terlihat pada tabel 2. Nilai absorbansi sampel tertinggi terdapat pada S₁ (0,174) dan nilai absorbansi terendah terdapat pada U₁ dengan hasil absorbansi menunjukkan nilai negatif (-0,006) karena di bawah nilai absorbansi kurva standar BSA. Nilai absorbansi dari keenam sampel menunjukkan perbedaan  dikarenakan jenis sampel protein yang digunakan berbeda-beda.

Hasil perhitungan persentase kadar protein dalam sampel pada tabel 2 di atas, menunjukkan bahwa kadar protein pada sampel S₁ sebesar 41,63%, S₂ sebesar 39,35%, S₃ sebesar 16,92%, S₄ sebesar 0,55%, U₁ sebesar -1,66% dan S₆ sebesar 0,98%. Dari hasil tersebut, terlihat bahwa kadar protein tertinggi adalah S₁ dan kadar protein terendah pada U₁.

Sampel S₁ dan S₂ memiliki konsentrasi yang pekat, sehingga perlu pengenceran total hingga 24.000 kali, sedangkan untuk sampel lainnya hanya diperlukan faktor pengenceran sebanyak 10.000 kali. Hasil perhitungan kadar protein pada sampel U₁ menunjukkan bahwa pada sampel U₁ memiliki kandungan ekstrak protein yang sangat kecil hingga tidak terdeteksi oleh spektrofotometri uv-vis.

Gambar 1. Absorbansi Standar (l) BSA pada 774 nm

	y = 0,0018x + 0,0097 R2 = 0,9887

 

Gambar 2. Kurva Kalibrasi Larutan Standar BSA

 

Gambar 3. Profil SDS-PAGE dari sampel D₂, D₁, D₃, S₂, A₁, A₄, A₄

Tabel 3. Nilai Rf (Retadartation Factor) pada sampel protein A₄

Running sampel dalam sumuran	Jarak pita protein dari batas atas gel pemisah (cm)	Jarak dari tracking dye dari batas atas gel pemisah (cm)	BM Marker (kDa)	Rf (Retadartation factor) (x)
A4	0,3	4,5	200	0,067
	0.3	4,5	115	0,067
	0,5	4,5	97,5	0,111
	0.8	4,5	66	0,178
	2	4,5	45	0,444
			31
			21,5
			14,5

Hasil yang tertera pada tabel 3, menunjukkan bahwa  nilai Rf dari sampel A₄ berada pada kisaran 0,06 – 0,44. Nilai Rf tertinggi berada pada pita ke-5. Rentang nilai Rf tersebut berati bahwa pemisahan yang terjadi berlangsung dengan baik.

PEMBAHASAN

Protein dapat dianalisis secara kuantitatif dan kualitatif. Analisis kuantitatif protein biasanya menggunakan sprektofotometer dengan panjang gelombang tertentu tergantung pada jenis protein dan preaksi yang dipakai (Fatchiyah et al, 2011). Penentuan kadar protein pada praktikum ini menggunakan metode Lowry, yakni metode pengkombinasian pereaksi Biuret dengan pereaksi lain (Folin) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein. Reaksi ini akan menghasilkan warna kebiruan (Hawab, 2004), sehingga pada uji protein, tabung pada sampel S₁ dan S₂ memiliki warna biru yang lebih pekat dan menjadi biru muda pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi.

Pembuatan larutan standar dengan berbagai variasi konsentrasi bertujuan untuk menentukan kadar protein dalam suatu sampel. Tujuan digunakannya metode Lowry pada praktikum pengukuran kadar protein karena metode ini memiliki beberapa kelebihan. Pertama, metode ini didasarkan pada kestabilan ikatan protein dengan protein Lowry sehingga absorban yang terbaca akan relatif stabil. Selain itu, karena interfensi zat lain menjadi lebih kecil disebabkan hanya protein yang berikatan dengan protein Lowry (Suryohastari, 2016). Menurut Mickelson dan Corton (2004), metode Lowry memiliki tingkat pengukuran yang lebih sensitif (1 μg hingga 100 μg), sehingga diperoleh data yang lebih valid. Namun kelemahannya adalah metode ini hanya dapat mengukur molekul peptida pendek (Lowry., et al, 1951).

Terdapat reagen pendeteksi fenolik yang digunakan dalam metode ini, yaitu folin. Folin berperan dalam penentuan konsentrasi protein. Dalam bentuk sederhana, folin dapat mendeteksi residu tirosin karena kandungan fenolik dalam residu tersebut dapat mereduksi fosfotungsat dan fosfomolibda menjadi tungsten dan molybdenum yang berwarna biru (Hawab, 2004). Selain itu, dalam metode ini juga terlibat dua buah pereaksi(pereaksi A dan pereaksi B) atau dikenal dengan pereaksi Biuret.

Kompleks Cu (II) protein terbentuk seperti metode Biuret, yang dalam suasana alkalis, Cu (II) akan tereduksi menjadi Cu (I), kemudian ion Cu⁺ akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat dan phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri (Soeharsono, 2006).

Terdapat beberapa zat yang dapat mengganggu penetapan kadar protein dengan metode Lowry, diantaranya adalah buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol, Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfihidril, disulfida, fenolat, asam urat, guanine, xanthine, magnesium, dan kalsium. Interferensi agen-agen tersebut dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferensi tersebut. Oleh karena itu, dianjurkan menggunakan blanko untuk mengoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa, dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein ( Lowry., et al, 1951).

Berdasarkan pada praktikum ini digunakan elektroforesis vertikal dengan menggunkan metode SDS PAGE dengan gel berbahan dasar polikrilamida karena sampel yang digunakan adalah sampel protein. Pemilihan komposisi stacking gel dan separating gel didasarkan pada berat molekul protein yang akan di – running, bila sampel protein yang akan di running belum diketahui berat molekulnya, maka digunakan gel dengan komposisi 12,5% terlebih dahulu, jika kemudian saat running terjadi loss protein, maka komposisi gel dinaikkan menjadi 25% dan seterusnya (Davidson, 2001).

Separating gel ini berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya, bahan yang digunakan dalam praktikum, yaitu akrilamid 30% sebagai bahan untuk membentuk pori-pori dalam gel, agar protein dapat terpisah berdasarkan ukurannya. 1 M Tris pH 8,8 berperan untuk menstabilkan pH buffer agar muatan dari protein tidak berubah. Akuades digunakan sebagai pelarut polar dan sebagai media polar untuk aliran listrik dalam gel. Sodium Dodesil Sulfat (SDS) digunakan untuk memutuskan ikatan disulfida dari protein agar menjadi unfolding dan menyelubungi protein dengan muatan negatif. Ammonium Persulfat (APS) digunakan sebagai katalisator dalam polimerasi gel poliakrilamid, dan TEMED digunakan sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat dan juga diginakan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur (Davidson, 2001).

Kondisi pH yang digunakan dalam separating gel, yaitu 8,8. Hal tersebut bertujuan untuk mendapatkan pori-pori yang lebih kecil sehingga protein akan terseparasi dengan baik saat running dan agar didapatkan protein tetap dalam keadaan bermuatan negatif. Larutan gel yang telah dibuat dimasukkan dalam plate untuk mencetak gel. Pemberian akuades di atas separating gel yang setengah padat bertujuan untuk membuat permukaan separating gel datar.

Gel kedua yaitu stacking gel yang berfungsi untuk tempat menata sampel protein sebelum proses running dimulai. Bahan yang digunakan dalam pembuatan stacking gel ini yaitu akrilamid-bis sebagai pembentuk pori-pori untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran yang dimilikinya. Tris pH 6,8 berfungsi untuk mempertahankan pH protein agar tidak berubah, sehingga protein akan tersusun secara berjajar pada bagian bawah dari stacking gel (Janson, 1998). Akuades sebagai pengencer, pelarut, dan pemberi kondisi polar untuk melancarkan arus listrik. Sisir dipasang untuk mencetak sumuran tempat sampel dimasukkan dalam gel.

Komposisi gel akan mempengaruhi hasil running sampel protein. Gel berperan sebagai pori atau saringan yang akan menyaring protein berdasarkan ukuran molekul. Protein dengan berat molekul kecil akan turun terlebih dahulu dengan cepat menuju ke dasar gel dan protein dengan berat molekul besar akan tertahan di gel bagian atas. Jika komposisi gel yang digunakan tidak sesuai, misalnya komposisi gel terlalu kecil maka pori dari gel menjadi longgar sehingga protein dengan berat molekul kecil akan terus turun, sedangkan jika komposisi gel terlalu besar maka pori dari gel menjadi rapat sehingga protein dengan berat molekul besar akan tertahan di atas (Janson, 1998).

Penggunaan larutan Reducing Sample Buffer (RSB) sebagai tracking dye berfungsi untuk menandai protein yang tersangkut di pori gel sebagai band. Pemanasan protein dilakukan sebelum pemberian RSB dengan tujuan untuk melepaskan ikatan protein yang rumit menjadi sebuah ikatan sederhana yang akan lebih mudah untuk dilakukan proses running elektroforesis.

Penambahan larutan RSB dengan perbandingan 1:1 karena RSB ini mampu memutus ikatan disulfida protein sehingga didapatkan protein dalam bentuk linier yang nantinya akan memudahkan separasi protein tersebut dalam gel saat running. Di dalam RSB terdapat kandungan 1 M Tris-HCl pH 6,8 untuk menjaga kondisi pH dari sampel protein, gliserol 50% berfungsi untuk menambah berat sampel sehingga mudah turun, SDS 10% berfungsi sebagai agen pereduksi yang memutuskan ikatan

Saat preparasi sampel digunakan disulfida sehingga protein berbentuk linier dan bermuatan negatif pada protein, fungsi pembentukan muatan negatif ini untuk memudahkan separasi menuju kutub positif saat dilewatkan arus (Janson, 1998).

Adapun kandungan yang lain yaitu terdapat 2-merkaptoethanol yang berfungsi untuk membantu reaksi SDS dalam memecah ikatan disulfida dari protein, dan Bromophenol Blue 1% sebagai penanda atau sebagai tracking dye untuk mempermudah dalam pengamatan pergerakan protein saat running (Janson, 1998). Larutan RSB yang digunakan dalam sampel tanaman sedikit berbeda dari sampel non tanaman, yaitu pada RSB untuk tanaman perlu ditambahkan DTT dan EDTA. Penambahan DTT ini untuk memecah ikatan disulfida dengan mendegradasi ikatan alifatik disulfide menjadi rantai polipeptida tunggal.

Jenis tanaman-tanaman tertentu dapat menghasilkan senyawa-senyawa metabolit sekunder, sehingga untuk memaksimalkan pemecahan disulfida yang dilakukan oleh SDS dan 2-merkaptoethanol diperlukan penambahan DTT dan EDTA (Janson, 1998). Setelah penambahan larutan RSB, sampel protein dipanaskan untuk mengoptimalkan proses dari pendenaturasian protein (Sudarmanto, 2008). Pada praktikum ini pemanasan dilakukan selama 5 menit di air mendidih dan tidak lebih dari 7 menit karena akan menyebabkan denaturasi protein.

Aliran listrik yang digunakan sebesar 120 Volt selama 2 jam yang berfungsi untuk memberi muatan pada protein untuk bergerak melewati pori gel dan bergerak dari atas ke bawah gel sesuai dengan berat molekul sampel protein tersebut dan agar protein dapat terseparasi dengan baik. Protein dengan berat molekul kecil akan bergerak terlebih dahulu dengan cepat melewati pori sampai batas di mana pori tidak cukup besar untuk melewati pori gel. Batas itulah yang terlihat sebagai band pada gel.

Aliran muatan listrik mengalir ke protein melewati running buffer yang diisikan pada kit elektroforesis yang berisi gel yang di running. Setelah itu dilakukan staining atau pewarnaan. Larutan staining yang digunakan dalam praktikum ini yaitu CBB R-250 (Coomasie Brilliant Blue), CBB ini sensitif terhadap protein yang memiliki ukuran yang berkisar antara 0,5 hingga 20 mikrogram (Janson, 1998). Penggoyangan perlu dilakukan untuk megoptimalkan reaksi staining yang dilakukan oleh CBB. Pencucian dengan aquades berfungsi untuk membilas dan menghilangkan CBB yang mungkin masih tersisa pada gel. Selanjutnya dilakukan perendaman pada larutan destaining untuk menghilangkan CBB yang tersisa dan memperjelas band protein yang terbentuk serta untuk menghilangkan CBB yang tidak berada pada band protein.

Pemberian kertas saring saat perendaman pada larutan destaining bertujuan memaksimalkan pembersihan larutan CBB. Setelah itu, dilakukan pencucian lagi dengan akuades untuk menghilangkan sisa larutan destaining dan menghentikan pewarnaan yang dilakukan oleh larutan destaining. Gel di scan untuk mendapatkan visualisasi lebih baik untuk analisis selanjutnya (William, 2001).

Kemudian berat molekul protein diidentifikasi dengan menentukan kurva baku dari marker protein dengan menggunakan Log dari berat molekul dan RF (hasil bagi tracking band dan tracking total). Setelah diketahui persamaan dari kurva baku, maka persamaan tersebut dapat digunakan untuk menghitung berat molekul dari sampel protein yang digunakan pada saat running (Rick, 2008).

Analisis profil pita protein dengan  teknik Sodium Dodecyl Sulfate – Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dapat digunakan untuk melihat profil protein dan menentukan BM atau berat molekul suatu protein (Stryer, 1995).

Metode gel satu dimensi umumnya menggunakan sodium dodesil sulfat (SDS) yang diperankan untuk solubilisasi, denaturasi dan memberikan muatan negatif pada suatu protein (Coligan, 1996). Protein dapat dipisahkan dari protein jenis lain atau dari molekul lain berdasarkan ukuran, kelarutan, muatan dan afinitas ikatan. Pemisahan protein merupakan tahap yang harus dilakukan untuk mempelajari karakter dan fungsi protein (Poedjiadi, 2007). Berbagai jenis protein pada suatu sampel akan terpisah-pisah pada gel poliakrilamid yang tergantung pada mobilitasnya, dengan demikian pada jalur pergerakan protein akan didapatkan jajaran protein yang disebut sebagai pita protein yang akan memisah berdasar ukuran BM protein (Fatchiyah et al., 2011).Tebal dan tipisnya pita-pita protein yang terlihat pada gel poliakrilamid merupakan gambaran dari banyaknya protein yang terkandung dalam berat molekul suatu protein.

Pada penelitian Gunanti (2010) menjelaskan bahwa tebal dan tipisnya pita protein pada hasil SDS-PAGE disebabkan karena terdapat perbedaan secara genetik antara protein tersebut. Pada gel poliakrilamid 12,5% hasil SDS-PAGE terdapat pita-pita protein yang dapat dihitung berat molekulnya. Penentuan berat molekul terhadap profil relatif pada tiap sampel difokuskan pada pita-pita yang berat molekulnya berada di bawah kDa. Pita protein dengan BM 45 kDa pada hasil elektroforesis SDS-PAGE dalam gel poliakrilamid 12,5% memperlihatkan intensitas warna yang paling jelas dan paling tebal, sehingga dapat digunakan sebagai acuan bagi sampel yang memiliki BM di bawah 45 kDa.

Pita-pita protein dengan BM di bawah 45 kDa berada pada urutan ke-1 sampai ke-3 dari bawah. Berdasarkan keadaan tersebut maka diperoleh lima pita yang digunakan untuk menentukan BM protein pada tiap sampel. Berat molekul protein yang terlihat pada setiap jalur sampel ditentukan melalui nilai Rf dari masing-masing pita protein. Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa pustaka menyatakan nilai Rf yang baik adalah yang menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah berkisar antara 0,2-0,8.

KESIMPULAN

Nilai kadar protein pada tiap sampel adalah S₁ (41,63%), S₂ (39,35%), S₃ (16,92%), S₄ (0,55%), U₁ (-1,66%) dan S₆ (0,98%) dengan persamaan linear y= 0,0018x + 0,0097 dan nilai R = 0,9887. Nilai Retadartation factor (Rf) tertinggi ada pada pita ke 5, dengan kisaran nilai Rf sebesar 0,06-0,44 yang berarti terjadi pemisahan protein yang cukup baik.

SARAN

Sebaiknya kuvet yang berisi blanko dan sampel dipastikan dalam keadaan kering agar pembacaan nilai absorbansi lebih akurat serta dalam pengambilan larutan yang berada di dalam mikrotube digunakan sebuah alat khusus guna mencegah sisa larutan tidak menempel di dinding mikrotube.

DAFTAR PUSTAKA

Coligan J. E. 1996. Current protocols in pro-tein science. John Wiley & Sons, Inc. Unit 4.7.

Davidson. 2001. SDS- PAGE. http://www.bio.davidson.edu/COURSES/GENOMICS/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html. Diakses tanggal 24 Oktober pukul 03.00 WIB.

Fatchiyah, E.L., Arumingtyas S., Widyarti, & Rahayu, S. 2011. Biologi molekuler prinsip dasar analisis. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Gunanti, M., Ulia, F., Sri, D. 2010. Karakterisasi protein Larnea cyprinacea dengan  metode elektroforesis SDS-PAGE. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, 2(1), 61-66.

Hawab, HM. 2004. Pengantar Biokimia. Bayu Media Publishing. Jakarta.

Hermansyah,. 2012. Penuntun Praktikum Biokimia. MIPA UNSRI. Inderalaya.

Janson, J.C, L.Ryden. 1998.  Protein Purification Principles, High-Resolution Methods and Applications. Second Edition.

Lowry, Rosenbrough, Farr, Randall. 1951. Protein Measurement with The Folin Phenol Reagent. Kluwer Academic Publishers. New York.

Mickelson, R., & Eduardo Corton. 2004. BioanalyticalChemistry, Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.

Poedjiadi, Anna. 2007.  Dasar Biokimia. UI Press. Jakarta.

Rick. 2008. Molecular station role of SDS in SDS-PAGE gel electrophoresis. . http://www.molecularstation.com/sds-page -gel -electrophoresis/. Diakses tanggal 24 Oktober 2016. Pukul  22.00 WIB

Soeharsono. 2006. Biokimia 1.UGM Press. Yogyakarta.

Stryer, L. 1995. Biokimia. penerjemah; Soebianto S, editor. Terjemahan dari: Biochemistry. Jakarta: EGC Penerbit Buku Kedokteran.

Sudarmanto, Arie. 2008. Protein.  http://ariebs.staff.ugm.ac.id. html. Diakses tanggal 24 Oktober. Pukul 22.00 WIB.

Suryohastari, Bhintarti Rr. 2016. Analisis Protein Defensin dari Biji Jinten Hitam (Nigella sativa L.) pada Mencit (Mus musculus) yang Diberi Biji Jinten Hitam Melalui Teknik SDS-Page. Jurnal Biologi Al-Kauniyah. 9(1), 26-36.

William. 2001. SDS PAGE Gel Elektrophoresis. http://web. chemistry.gatech.edu/~williams/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/page_protein.html. Diakses tanggal 24 Oktober 2016 pukul 06.00 WIB