UJI KUALITATIF DAN UJI KUANTITATIF DNA

UJI KUALITATIF DAN UJI KUANTITATIF DNA

QUALITATIVE AND QUANTITATIVE TEST OF DNA

drh. Rr. Bhintarti Suryo Hastari, M. Biomed, Festy Aulyaur Rahmah, S.Si , Maulana Malik Assayiddin, Puri Dwi Nurmaulida, Ratna Lestyana Dewi^*

Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

*Corresponding author : lestyanaratna@gmail.com

 

Abstrak

                Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia penting pada makhluk hidup karena mengandung informasi genetik dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Isolasi DNA dilakukan  untuk memisahkan DNA dari bahan lain dengan prinsip sentrifugasi dan presipitasi. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan dengan uji kualitatif. Tujuan praktikum ini adalah mampu melakukan isolasi DNA kromosomal bakteri dan juga melakukan uji kuantitatif DNA kromosomal. Metode dalam praktikum ini yaitu preparasi sampel, isolasi DNA, amplifikasi, elektroforesis horizontal gel agarosa, uji kuantitatif dengan sprektofotometer, dan sequencing DNA dengan metode sanger. isolasi DNA bakteri 16S RNA menghasilkan 3 tabung sampel ekstraksi dari bakteri Bacillus cereus dan 3 tabung sampel dari Acetobacter xylinum. Pada tahap amplifikasi dengan PCR, dihasilkan 12 tabung sampel dengan 2 macam formula yang dibedakan berdasarkan komposisi volume dari DNA template serta komposisi primer. Pada tahapan elektroforesis dihasilkan 14 pita DNA ladder dan 4 pita sampel yang terlihat sejajar dengan pita Marker. Nilai kemurnian DNA berada pada kisaran 0,304-0,771 sedangkan nilai konsentrasi berada pada kisaran 25-135 µg/ml.  Secara keseluruhan sampel, nilai kemurnian DNA berada di bawah 1,8, sehingga dapat dikatakan bahwa sampel DNA kurang murni dan kurang bersih.

Kata kunci: Amplifikasi, DNA, Purifikasi

Abstract

            Deoxyribonucleic acid (DNA) is an important chemical compound found in living organisms because it contains genetic information from one generation to the next. Isolation of DNA is done to separate the DNA from other materials with the principle of centrifugation and precipitation. Quantitative DNA test is an analysis to determine the content or the amount of DNA present in a substance or substances which components have previously been shown the presence of DNA plasmids in the solution with the qualitative test. The purpose of this lab is able to isolate the chromosomal DNA of bacteria and also perform a quantitative test of chromosomal DNA. The method in this lab is sample preparation, DNA isolation, amplification, horizontal agarose gel electrophoresis, quantitative assay with sprektofotometer, and DNA sequencing by the Sanger method. DNA isolation of bacterial 16S RNA extraction produces three sample tubes from the bacterium Bacillus cereus and 3 tube samples of Acetobacter xylinum. At this stage of amplification by PCR, produced 12 sample tubes with 2 different formula compositions are distinguished by the volume of DNA template and primer composition. At that stage produced 14 DNA electrophoresis ladder and four tape samples seen juxtaposed with a ribbon Marker. DNA purity value in the range of 0.304 to 0.771, while the concentration in the range of 25-135 pg / ml. Overall samples, DNA purity values ​​were under 1.8, so it can be said that the DNA sample is less pure and less clean.

Keywords: Amplification, DNA, Purification

PENDAHULUAN

            Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia paling penting pada makhluk hidup karena mengandung informasi genetik dari satu generasi ke generasi (Suryo, 2004). Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom terdiri dari bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. Bakteri termasuk organisme pokariotik yang memiliki DNA berbentuk sirkular dan terletak di dalam sitoplasma (Jusuf, 2001).        Kromosom adalah suatu struktur makromolekul yang berisi DNA dan menyimpan informasi genetik. Sekuens DNA yang terletak pada kromosom disebut dengan DNA kromosomal.         

            Kromosom merpakan pembawa gen yang terdapat di dalam inti sel (nukleus). Kromosom terdiri dari DNA, RNA dan protein. Kromosom terdiri atas dua bagian, yaitu sentromer yang merupakan pusat kromosom berbentuk bulat dan lengan kromosom yang berjumlah sepasang (Handoyo, 2001). 

            Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.

            Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Abinawanto, 2011).

            Tahap lanjutan dari isolasi DNA adalah amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). Teknik tersebut dapat bermanfaat dalam memperbanyak jumlah DNA agar dapat dimanfaatkan lebih maksimal karena jumlahnya lebih banyak. Hasil dari PCR dapat dilihat pada elektroforesis gel untuk mengetahui visualisasi dari tahapan-tahapan di atas dan  mengetahui berat molekul dari pita DNA target (Handoyo, 2011).

            Uji kuantitatif DNA adalah suatu analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan dengan uji kualitatif. DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein atau fenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini maka kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280, dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah, 2011).

            Rasio yang kurang dari 1,8 menunjukan bahwa preparasi DNA telah terkontaminasi baik oleh fenol maupun protein. Rasio yang dengan nilai di atas dua menandakan bahwa preparasi DNA telah terkontaminasi oleh RNA.

            Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA pengkode gen 16S rrna dari bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum yang kemudian dilakukan uji kulitatif DNA yang terdiri dari amplifikasi DNA dan identifikasi fragmen DNA dengan elektroforesis horizontal gel agarose, kemudian dilanjutkan dengan uji kuantitatif dengan sprektofotometer uv-vis.

MATERIAL DAN METODE

                Praktikum ini dilakukan pada tanggal  7, 14, 21, 28, November dan 5 Desember 2016 di Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah biakan koloni bakteri cair Bacillus cereus dan Asetobacter xylinum, H₂O, instagene matriks,  gen rRNA 16S, primer 27 F  dan 1492 R, dream taq green 2x master mix + dye, nuclease free water, peq green, buffer TAE 1x, marker, loading dye, dan gel agarose 1%, sampel ekstraksi DNA bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum dan akuabides.

            Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah mikrotube, sentrifuge, mikropipet, water bath, vortex, thermocycler (PCR machine) tangki elektroforesis, transluminator UV, erlenmeyer, microwave,  sisir, spektrofotometer, kuvet dan kamera.

Preparasi DNA Bakteri dengan Instagene Matriks

            Biakan koloni cair bakteri Bacillus cereus dan Asetobacter xylinum diresuspensi dalam 1 ml di dalam H₂O, selanjutnya di sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Kemudian seupernatan dibuang dengan menggunakan mikropipet, kemudian pellet ditambahkan dengan 100µl instagene matriks strirrer moderated speed. Selanjutnya diinkubasi di dalam water bath dengan suhu 56⁰C selama 30 menit, kemudian divortex selama 10 detik, dan diinkubasi kembali dengan suhu 100⁰C selama 8 menit. Kemudian divortex selama 10 detik, di sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit. Kemudian super natan dipindahkan ke dalam tabung baru dan disimpan dalam suhu 4⁰C.

PCR Gen 16S rRNA

Isolat bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum yang ada di microtube, masing-masing dibagi menjadi 2 tipe yaitu a untuk Acetobacter xylinum dan b untuk Bacillus cereus. Tipe a di masukkan formula 2x dream taq green RM+dye sebanyak 12,5 µl menggunakan mikropipet, kemudian ditambahkan DNA template sebanyak 10 µl, 10 µM primer 27F sebanyak 1,25 µl, 10 µM primer 1492 R sebanyak 1,25 µl setelah itu, sampel dihomogenkan menggunakan vortex dalam waktu 5 detik. Tipe b dimasukkan formula 2x dream taq green RM+dye sebanyak 12,5 µl menggunakan mikropipet, kemudian ditambahkan DNA template sebanyak 1 µl, 10 µM primer 27F sebanyak 0,5 µl, 10 µM primer 1492 R sebanayak 0,5 µl, dan nuclease free water sebanyak 10,5 µl, setelah itu dihomogenkan  menggunakan vortex dalam waktu 5 detik. Selanjutnya, PCR di set dengan suhu pre-denaturasi 95⁰ C selama 5 menit, denaturasi 95⁰C selama 30 detik, anneling 51⁰ C selama 30 detik, ektensi 72⁰ C selama 2 menit, final ekstensi 72⁰C selama 10 menit, dan stop pada suhu 4⁰ C. Microtube disusun di dalam Thermocycler pada bagian tengah, dan ditekan tombol start dan didiamkan hingga proses selesai.

Elektroforesis Gel Agarose

Pembuatan gel agarose yaitu dengan memasukkan gel agarose 1% sebanyak 0,25 gram dan 25 ml buffer TAE 1x ke dalam erlenmeyer, selanjutnya erlenmeyer dimasukkan ke dalam microwave selama 30 menit, dimasukkan peq green sebanyak 1 µl pada saat gel agarose bersuhu 50⁰C yang kemudian dihomogenkan. Selanjutnya gel agarose yang sudah homogen dimasukkan ke dalam cetakan dengan posisi yang seimbang. Sebelum meletakkan gel agarose di dalam cetakan, diletakkan sisir cetakan terlebih dahulu yang diletakkan pada urutan ke 8 dan 15, setelah itu baru gel agarose dituang ke dalamnya. Gel agarose akan berubah menjadi warna keabu-abuan jika sudah memadat. Kemudian gel agarose dimasukkan pada chamber. Produk PCR b dimasukkan pada sisir B dengan menggunakan mikropipet. Proses pemasukkan sampel dilakukan dari sisi kiri menuju sisi kanan. Formula marker terdiri dari 1 µl marker ditambah 1 µl loading dye, dan 4 µl air, sedangkan formulasi ekstraksi sampel sebanyak 5 µl ditambah 1 µl loading dye. Sampel dimasukkan pada cetakan gel agarose sesuai formasi yang telah ditentukan sebelumnya. Kemudian, lalu dilakukan tahapan running elektroforesis dengan panjang gelombang 80V, tegangan 400mA selama 45 menit.

Transluminator UV

Hasil running pada elektroforesis divisualisasikan menggunakan sinar UV pada transluminator. Gel agarose diletakkan di atas transluminator UV dengan perlahan, selanjutnya ditutup dengan penutup kaca anti sinar UV, digunakan kaca mata pelindung anti sinar UV, selanjutnya dinyalakan saklar lampu UV dan diamati pita DNA yang tampak dan didokumentasikan.

Uji Kuantitatif DNA

            Hasil ekstraksi dithowing terlebih dahulu untuk memastikan sampel sudah tidak terlalu dingin, kemudian divortex selama 10 detik. Lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit. Selanjutnya, sampel yang akan digunakan konsentrasinya diencerkan hingga 100x (10 µl sampel DNA dan 990 µl akuabides), sampel yang telah diecerkan lalu dimasukkan pada mikrotube baru dan divortex 10 detik. Kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit. Setelah itu dipindahkan ke dalam kuvet dan diukur nilai absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm di spektrofotometer UV-Vis.

HASIL DAN PEMBAHASAN

      Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA dapat ditemukan di kromosom inti maupun di organel (Fatchiyah, 2011). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi dan presipitasi. Sementara itu, prinsip utama dalam isolasi DNA yaitu sentrifugasi dan presipitasi.

Praktikum ini menggunakan bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum yang kemudian diisolasi DNA-nya. Isolasi DNA bakteri digunakan dream taq green 2x master mix atau yang disebut sebagai instagene matriks, merupakan sebuah kit yang sudah diproduksi secara konvensional yang berfungsi untuk mempercepat proses dalam tahapan isolasi DNA. Kandungan yang terdapat di dalamnya yaitu air dan terdapat polystyrene divinyl benzeneiminodiacetate (Biosciences, 1999).

Isolasi DNA memiliki prinsip untuk memisahkan DNA kromosom atau atau DNA genom dari komponen sel yang lain. Setelah kultur disentrifugasi didapat endapan putih yaitu berupa supernatant. Prinsip utama dari sentrifugasi yaitu memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul, sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar. Prinsip dari presipitasi yaitu pengendapan DNA agar terpisah dari zat lain yang terdapat di sel (Handoyo, 2001).

 Isolasi DNA bakteri menggunakan metode boiling dengan melakukan pemanasan suhu tinggi selama beberapa menit yang menyebabkan meningkatnya permeabilitas dinding sel yang berakibat masuknya cairan dan materi lain di sekitar sel dan keluarnya materi dari dalam sel. Suhu tinggi berfungsi untuk inaktifasi enzim, terutama DNA-ase yang dapat merusak DNA. Suhu yang digunakan dalam pemanasan tergantung pada sampel yang digunakan. Ekstraksi DNA dengan metode boiling mudah untuk dilakukan karena hanya membutuhkan waktu yang tidak terlalu lama, namun kualitas yang dihasilkan relative lebih rendah dibandingkan dengan metode lain (Sunarno, 2014).

Polymerase chain reaction (PCR) merupakan salah satu teknik yang bertujuan untuk memperbanyak DNA secara in vitro dalam suatu reaksi termal. Teknik PCR terdiri atas tiga tahap yaitu denaturasi, annealing, dan polimerisasi. Denaturasi berlangsung pada suhu 94^o C selama 30 detik. Saat tahap denaturasi, reaksi enzimatik berhenti dan ikatan hidrogen terputus sehingga DNA untai ganda berpisah menjadi DNA untai tunggal. Annealing berlangsung pada suhu 55^o C selama 3 detik. Kemudian pada tahap tersebut primer menempel pada DNA template di tempat yang berkomplemen dengan sekuens primer. Tahap terakhir yaitu polimerisasi berlangsung selama 30 detik pada suhu 72^o C merupakan proses pemanjangan primer menggunakan untai tunggal DNA sebagai cetakannya. DNA polimerase akan memasangkan dNTP yang sesuai dengan pasangannya (Davis, 1994).

 Prinsip kerja PCR (Polymerase Chain Reaction) yaitu  menggunakan reaction mixture serta memanfaatkan enzim dari DNA polimerase yang bersifat termostabil dan fragmen DNA yang pendek disebut primer. Primer berfungsi untuk mensintesis secara langsung sekuens DNA target spesifik dari DNA template. Reaksi sintesis tersebut terus berulang sehingga membentuk suatu siklus (Sunarno, 2014). Adapun komponen-komponen dalam reaction mixture PCR yaitu H₂O steril, fungsinya sebagai pelarut campuran. Buffer berfungsi untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. Buffer biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia. Komponen lainnya yaitu dNTP (deoxynucleoside triphosphate) sebagai pembentuk basa komplementer dan penyusun DNA, terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP (Tarigan, 2011).

Primer atau disebut juga dengan oglinukleotida (sepasang DNA utas tunggal pendek) merupakan suatu fragmen yang terdiri atas 20-30 basa dan berkomplemen secara spesifik dengan DNA cetakan. Syarat primer yang baik yaitu memiliki panjang basa oglinukleotida 18-24 basa, mempunyai urutan basa-basa spesifik untuk melekat pada DNA cetakan, tidak terdapat basa-basa yang berkomplemen pada ujung 3’, komposisi basa guanin (G) dan sitosin (C) adalah 50% dari seluruh basa, dan memiliki suhu melting yang tidak berbeda jauh (Agustian, 2008). Primer berfungsi untuk menginisiasi sintesis DNA pada sekuens target yang spesifik dan membatasi reaksi polimerisasi DNA (Tarigan, 2011).

Primer terdiri dari dua macam, yaitu primer forward dan primer reverse. Primer forward untuk menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 5’ ke ujung 3’, sedangkan primer reverse menginisiasi sintesis DNA dari ujung 3’ ke ujung 5’. Kation divalen terdiri dari ion logam bivalen (umumnya Mg²⁺) dan ion logam monovalen (K⁺), berfungsi sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion-ion tersebut enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja (Science biotech.net, 2011). DNA template adalah DNA yang memiliki sekuens target untuk penempelan primer, berfungsi sebagai cetakan DNA yang akan diamplifikasi (Agustian, 2008). Komponen yang terakhir yaitu enzim DNA polymerase berfungsi untuk membaca kode DNA serta menghubungkan pasangan nukleotida dalam menghasilkan salinan DNA (Sunarno, 2014).

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).

Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif melalui membran matriks gel agarose (Yuwono, 2005).

Elektroforesis yang ada saat ini terdapat dua jenis yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Adapun elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk analisis DNA.

Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses berlangsung, sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dapat disimpan dan didinginkan setelah percobaan, sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu. Adapun kekurangan dari metode ini yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran sampel ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984).

            Teknik elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 1%.  Proses pembuatan gel agarose 1% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarose dengan larutan buffer TAE 1x yang kemudian dipanaskan di dalam microwave selama 30 detik, selanjutnya diberikan 1ul pewarna peq green (pada suhu 50⁰C) dan kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras.  Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,25 gr dan larutan running buffer TAE 1x (Trisasetat-EDTA) sebanyak 25 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner, 1991). 

            Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin, 2012).

            Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 6µl dan juga larutan marker sebanyak 6µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel. Sedangkan untuk marker dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak melebihi batas ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO₄) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).

            Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi.  Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Martin, 1996).

            Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 80 V dan dengan arus sebesar 400 mA selama 45 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna.  Dokumentasi dilakukan dengan transluminator UV (Davis dkk, 1994).

Berdasarkan dari hasil di atas, terlihat bahwa terbentuk 14 pita DNA ladder pada Marker (M). Bedasarkan pita tersebut, 3 pita DNA ladder dengan ukuran DNA sebesar 6000 bp, 3000 bp, dan 1000 bp lebih terlihat jika dibandingkan dengan pita DNA ladder lainnya. Berdasarkan skala pada transluminator UV, jarak sampel terhadap sumuran berada pada jarak 4 cm. Pada gambar di atas, hasil terlihat jelas pada sampel 1b-4b. Sedangkan, pada sampel 5b dan 6b diperkirakan adanya kesalahan dalam memasukkan sampel ke dalam sumuran. Kesalahan tersebut dapat berupa tertusuknya gel agarosa saat pemauskan sampel (Handoyo, 2011).

Selanjutnya, pada tahapan pemasukan sampel sebelum proses elektroforesis, pada sampel hasil PCR (1a-6a dan 1b-6b) tidak diberikan campuran loading dye disebbakan pada tahap PCR, sampel tersebut telah ditambahkan kit Instagene Matrix berupa 2x Dream Taq Green RM + Dye. Kit ini kandungan yang terdapat di dalamnya yaitu air dan polystyrene-divinylbenzene iminodiacetate (Biosciences, 1999).

Berdasarkan hasil elektroforesis pada gambar 1, terlihat adanya pita yang terseparasi dan sejajar dengan marker yang berukuran 1500 bp. Hal ini mengindikasikan bahwa fragmen gen yang teramplifikasi memiliki ukuran kurang lebih 1500 bp. Hasil ini sesuai dengan teori yang ada yaitu menyatakan bahwa molekul fragmen gen 16 S RRNA bakteri memiliki ukuran 1500 bp, sehingga proses amplifikasi ini berhasil dilakukan. Gen 16 S RRNA merupakan kerangka penyusun ribosom yang memiliki peran yang sangat penting di dalam sinteisi protein dan dimiliki oleh semua sel sehingga semua organisme dapat dibandingkan secara setara, selain itu gen ini paling sering digunakan dalam mengidentifikasi bakteri (Biosciences, 1999).

                                          Tabel 1. Jarak Migrasi DNA Ladder

Ukuran DNA (bp)	Jarak Migrasi (mm)
10000	23
8000	25
6000	27
5000	28
4000	30
3500	31
3000	33
2500	35
2000	38
1500	41
1000	45
750	48
500	52
250

Ket : Warna biru menunjukkan jarak migrasi terdekat

Warna hijau menunjukkan jarak migrasi terjauh

Gambar 2. Kurva Standar DNA Ladder

Berdasarkan hasil di atas, terlihat bahwa jarak terdekat dari sumuran terdapat pada ukuran DNA 10000 bp sebesar 23 mm dan jarak terjauh dari sumuran terdapat pada ukuran DNA 500 bp sebesar 52 mm. Hasil pada tabel 1 ditunjukkan dengan kurva standar DNA ladder pada gambar di atas. Kurva tersebut menunjukkan bahwa semakin besar ukuran pita DNA ladder maka jarak migrasi akan semakin dekat dengan sumuran. Kurva tersebut dibuat dengan tujuan sebagai acuan standar skala dalam menentukan jarak pita sampel DNA terhadap DNA marker/ DNA ladder.

Tabel 2. Hasil Uji Kuantitatif DNA dengan Sprektofotometer

Kelompok	Kode Sampel	Nilai Absorbansi (nm)		Kemurnian DNA	Konsentrasi DNA (µg/ml)
		l = 260	l= 280
1	Bc1	0.017	0.029	0.586	85
2	Bc2	0.005	0.012	0.417	25
3	Bc3	0.022	0.038	0.579	110
4	Ax4	0.007	0.023	0.304	35
5	Ax5	0.027	0.035	0.771	135
6	Ax6	0.019	0.027	0.704	95

Berdasakan pada praktikum uji kuantitatif DNA digunakan sampel isolasi bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum. Uji ini menggunakan bantuan alat spektrofotometer. Uji kuantitatif  merupakan metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Spektofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu (Fatchiyah, 2012).

Kode Bc menunjukkan sampel bakteri Bacillus cereus dan sampel Ax menunjukkan sampel Acetobacter xylinum. Konsentrasi dan nilai kemurnian DNA tertinggi pada masing-masing kelompok sampel (Bc dan Ax), yakni terdapat pada  sampel kelompok 3 dan pada sampel kelompok 5. Nilai yang dihasilkan pada sampel kelompok 3 sebesar 0,579 dan 110 µg/ml dan pada sampel kelompok 5 sebesar 0,771 dan 135 µg/ml. Nilai kemurnian dan konsentrasi DNA  pada sampel Bc dan  Ax memiliki nilai yang bervariasi. Nilai kemurnian berada pada kisaran 0,304-0,771 sedangkan nilai konsentrasi berada pada kisaran 25-135 µg/ml.  Secara keseluruhan sampel, nilai kemurnian DNA berada di bawah 1,8. Nilai kemurnian DNA berbanding lurus dengan nilai konsentrasi DNA nya. Semakin tinggi nilai kemurnian DNA nya maka semakin tinggi pula nilai konsentrasi DNAnya.

            Uji kuantitatif DNA merupakan analisis untuk mementukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat di dalam suatu sampel. DNA dan RNA menyerap pada panjang gelombang maksimal 260 nm, sementara protein menyerap kuat pada gelombang 180 nm. Selain itu, asam nukleat dapat menyerap secara signifikan pada panjang gelombang 280 nm dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260 nm. Sehingga untuk mengukur dengan akurat konsentrasi DNA, RNA, dan protein dalam suatu campuran yang kompleks bukan hal yang mudah. Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dapat memberikan validasi kemurnian sampel asam nukleat dengan nilai 1,8 untuk DNA dan 2,0 untuk RNA yang mengindikasikan sampel murni. Nilai yang rendah akan menunjukkan adanya kontaminan lain atau terdapatnya protein (Teare, 2009).

            Absorbansi spektrofotometri adalah teknik yang cepat dan akurat untuk menentukan konsentrasi sampel DNA murni. Hal ini menjadi kurang akurat ketika sampel DNA mengandung protein, RNA, oligonukleotida primer atau nukleotida. RNA, primer dan nukleotida menyerap kuat pada 260 nm dan tidak bisa dibedakan dari DNA. Kontaminan seperti protein dapat menyebabkan kelebihan isi DNA dalam sampel campuran. Masalah ini dapat diatasi dengan menggunakan metode alternatif untuk mengukur DNA saja dalam sampel dan dapat diatasi juga dengan menambahkan suatu senyawa  berfluoresensi, yaitu DNA quant 200. Metode pemurnian sampel (DNA) juga dapat dilakukan secara kimiawi,  yaitu dengan cara merusak sel kemudian diberi buffer lisis yang berisi senyawa kimia yang dapat merusak integritas barrier dinding sel, senyawa kimia yang dipakai diantaranya lisosom, EDTA (etilen diamin, tetra asetat), Tris-CL atau deterjen, SDS (sodium dosecycle sulphate) (Gardner, 1991).

            Berdasarkan hasil yang didapat dari analisis kuantitatif DNA bakteri Bacillus cereus dan Acetobacter xylinum dengan menggunakan alat spektrofotometer, nilai kemurnian DNA dari kedua sampel bakteri tersebut tidak ada yang mendekati nilai 1,8 sehingga DNA dapat dikatakan memiliki tingkat kemurnian DNA yang rendah. Hal ini menunjukkan bahwa masih banyak terdapat pengotor fenol dan protein. DNA yang murni memiliki rasio 1,8. Apabila nilai rasio lebih dari 1,8 menunjukkan adanya RNA, hal ini karena RNA juga diserap pada panjang gelombang yang sama yaitu λ260 - λ280 nm.

            Berdasarkan nilai absorbansi pada l=260 nm dari kedua DNA bakteri tersebut, dapat dikatakan DNA kromosomal kedua bakteri yang diisolasi memiliki tingkat kemurnian yang rendah dan kurang bersih. Menurut Restu, dkk (2012), secara teoritis sampel DNA yang dianggap cukup murni memiliki perbandingan A260/A280 = 1,8-2,0. Tingkat kemurnian DNA yang rendah dapat dimungkinkan terdapatnya kontaminasi fenol. Rasio OD 260/OD 280 < 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi fenol atau protein hasil ekstraksi.  Umumnya pemurnian DNA  dilakukan dengan penambahan larutan fenol, klorofom, dan isoamil alcohol yang berfungsi untuk menghilangkan senyawa yang dapat mengkontaminasi DNA (Mulyani, 2011). Pemurnian DNA dengan penambahan fenol dan kloroform berguna untuk mengendapkan protein dengan melalui proses sentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan protease (Thermo Scientific, 2009).

            DNA yang telah dibersihkan dari protein menggunakan fenol, masih bercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA, karena ekstraksel mengandung protein dan RNA disamping DNA dalam jumlah yang besar (Thermo Scientific, 2009). Praktikum uji kuantitatif DNA tidak menggunakan penambahan enzim RNAse sehingga kemungkinan masih banyaknya RNA yang terkandung di dalam sampel, sehingga menyebabkan nilai kemurnian kedua DNA bakteri tersebut kurang dari 1,8.

KESIMPULAN

            Isolasi DNA bakteri 16S RNA menghasilkan 3 tabung sampel ekstraksi dari bakteri Bacillus cereus dan 3 tabung sampel dari Acebacter xylinum. Tahap amplifikasi dengan PCR menghasilkan 12 tabung sampel dengan 2 macam formula yang dibedakan berdasarkan komposisi volume dari DNA template serta komposisi primer. Sementara pada tahap elektroforesis menghasilkan 14 pita DNA ladder dan 4 pita sampel yang terlihat sejajar dengan pita Marker. Sementara itu, pada hasil uji kuantitatif DNA disimpulkan bahwa tingkat kemurnian DNA dari keseluruhan sampel adalah kurang bersih dan kurang murni karena menunjukkan nilai <1,8.

SARAN

            Praktikum harus dilakukan dengan langkah-langkah yang tepat sesuai dengan yang diajarkan agar mendapatkan hasil yang maksimal. Jumlah komposisi dan takaran bahan harus tepat untuk mendapatkan hasil yang maksimal. Selain itu, DNA yang telah diekstraksi perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel yang lain agar DNA yang diperoleh memiliki nilai kemurnian yang tinggi. Selain itu, perlu dilakukannya pemurnian kembali dan penambahan proteinase karena nilai kemurnian DNA yang didapat masih menujukan angka <1,8.

DAFTAR PUSTAKA

Abinawanto, R. Lestari, A. Bowolaksono, M. Dian, D. P. Astuti & H. Yasmin. 2011. Pedoman praktikum genetika dasar. PT. Pandu Aksara, Jakarta Timur: iii + 77 hlm.
BIO-RAD. 2015. Safety Data Sheet. OSHA HCS.

Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis.Amersham Bioscience : USA.

Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field gel electrophoresis: a practical guide. Academic Press, Inc., San Diego

Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2^nd ed. Appleton & Lange, Norwola

Fatchiyah, Arumingtyas Laras. E, Widyarti Sri, dan Rahayu Sri. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analis. Erlangga. Jakarta

Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8^th ed. John Wiley & Sons Inc., New York.

Handoyo, D. & R. Ari. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction            (PCR). PCR 9: 17-28. Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).

Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek : Bogor.

Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka, Croatia.

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford.

Sunarno et al. 2014. Metode Cepat Ekstraksi DNA Corynebacterium diphtheria untuk        Pemeriksaan PCR. Departemen Mikrobiologi Klinik. Fakultas Kedokteran Universitas    Indonesia.

Suryo. 2004.  Genetika. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked   Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011.

Teare, J.M. et al. 2009. Measurement of Nucleic Acid Concentration Using the DyNa QuantTM and the GenequantTM. BioTechniques. 1997;22(6):1170-1171.

Thermo Scientific. 2009. Thermo Scientific Pierce Cell Lysis Technical Handbook : Featuring Cell Lysis Reagent and Detergents Vol. 11, No.8