PENGENALAN ALAT-ALAT ANALISIS MOLEKULAR

PENGENALAN ALAT-ALAT ANALISIS MOLEKULAR

Fuzi Muchlissoh¹⁾, Muhammad Faiz ¹⁾, Mutia Afifah¹⁾ Ratna Lestyana Dewi¹⁾ , Rizky Hastuti Purwaningsih¹⁾ Maulana Malik Assayiddin²⁾, dan Puri Dwi Nurmaulida ²⁾

1.       Mahasiswa Program Studi Biologi

2.       Asisten Dosen Praktikum Biologi Molekular Prodi Biologi

Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Abstrak

Biologi molekular merupakan cabang ilmu biologi yang mengkaji mengenai kehidupan secara skala molekular. Pengenalan alat merupakan langkah pertama sebelum melakukan praktikum atau penelitian. Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa dapat memahami prinsip kerja alat-alat yang digunakan dalam praktikum biologi molekular, antara lain mikropipet, sentrifugasi, spektrofotometer uv-vis (DNA/RNA calculator), elektroforesis horisontal, transluminator uv dan thermocyler (PCR machine) serta dapat mengoperasikan alat-alat tersebut dengan benar. Praktikum ini dilakukan pada hari Senin, 26 September 2016 pukul 08.00 – 10.30 WIB di laboratorium Fisiologi dan Biologi Molekular Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Hasil yang diperoleh yaitu terdapat beberapa alat-alat analisis molekular seperti mikropipet, sentrifuga, spektrofotometer uv-vis (DNA/RNA calculator), elektroforesis horisontal, transluminator uv dan thermocyler (PCR machine). Alat-alat tersebut merupakan alat utama yang digunakan dalam bidang molekular. Kesimpulannya adalah alat-alat yang digunakan dalam praktikum biologi molekular mempunyai cara dan prinsip kerja yang berbeda-beda. Selain itu juga dapat meminimalisir resiko kesalahan kerja pada saat melakukan praktikum biologi molekular. Setiap pengguna harus mengikuti hal-hal tersebut agar dalam menggunakan alat-alat laboratorium tidak terjadi kerusakan alat ataupun hal-hal yang berbahaya.

Kata Kunci : DNA, elektroforesis, molekular

Abstract

                Molecular biology is a branch of the biological sciences study of the lives of molecular in scale. The introduction of instrument is a first step prior to lab work or research.The purpose of lab work this is a student can understand the principle of the tools used in lab work molecular biology, among others micropipet, centrifugation, of the spectrophotometer uv-vis (DNA/RNA calculator), electrophoresis horizontal , transluminator uv and thermocyler (pcr machine) and can operate the devices in truth. Lab work this started on monday , September 26th 2016 at 8 am - 10.30 a.m in the laboratory physiology and molecular biology center of laboratory integrated (PLT) Syarif Hidayatullah State Islamic University of Jakarta. The results are some tools molecular as micropipet analysis, these centrifuges, of the spectrophotometer uv-vis (DNA/RNA calculator), electrophoresis horizontal, transluminator uv and thermocyler (pcr machine) . Such tools are the main tool used in the field of molecular. The conclusion is that the tools used in molecular biology lab and working principles have a way different. It also minimizes the risk of errors when performing work on the molecular biology lab. Each user must follow these things in order in the use of laboratory equipment no damage tools or things that are dangerous.

Keywords: DNA, electrophoresis, molecular

PENDAHULUAN

Biologi molekular merupakan cabang ilmu biologi yang mengkaji mengenai kehidupan secara skala molekular. Pengenalan alat merupakan langkah pertama sebelum melakukan praktikum atau penelitian. Alat adalah suatu pendukung dari keberhasilan suatu pekerjaan di laboraturium, untuk memudahkan dan melancarkan keberlangsungan praktikum mengenai penggunaan alat sangat diperlukan (John, 2011). Pengenalan alat dapat memberitahukan berbagai macam alat-alat yang ada di laboratorium yang akan digunakan. Setiap alat memiliki prinsip dan cara kerja yang berbeda-beda, sehingga pengguna perlu mengetahui prosedur-prosedur dalam menjalankan suatu alat di laboraturium agar tidak terjadi kerusakan atau hal lainnya. (John, 2011).

Mikropipet merupakan alat yang digunakan untuk memindahkan cairan yang bervolume kecil yaitu <1000µl. terbagi menjadi dua tipe yaitu adjustable volume pipette yaitu mikropipet yang volume pengambilannya dapat diatur, yang memiliki kisaran antara 1 µl -20 µl, atau fixed volume pipettemerupakan mikropipet yang volumenya tidak dapat diatur  yang berukuran 5 µl (Khopkar, 1990).

Sentrifuga merupakan alat yang dapat mengendapkan partikel dalam suatu larutan. Semakin besar kekuatan sentrifugalnya maka semakin cepat pengendapannya. pengendapan terjadi saat suatu sampel diberikan kecepatan tertentu dan hal ini bergantung pada jari-jari dari sentrifugator (Cheesbrough, 2005).

Spektrofotometer UV-VIS merupakan pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahay tampak yang diabsorbsi oleh sampel (Triyati, 1985). Digunakan juga sebagai pengukur tingkat kemurnian DNA hasil isolasi. (Khopkar, 1990).

Elektroforesis merupakan suatu teknik untuk mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel bermuatan dalam suatu medan listrik, teknik ini menggunakan medium berbentuk gel yang dipengaruhi oleh faktor ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, kuat medan listrik dan lain-lain. Thermocycler atau PCR yaitu polymerase chain reaction yang merupakan alat teknologi utama dalam bidang biologi molecular. PCR memiliki derajat spesifitas dan sensivitas yang cukup tunggi, dengan waktu yang singkat dapat diperoleh jutaan copy DNA (Cheesbrough, 2005).

Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa dapat memahami prinsip kerja alat-alat yang digunakan dalam praktikum biologi molekular, antara lain mikropipet, spektrofotometer uv-vis (DNA/RNA calculator), sentrifuga ,elektroforesis horizontal, transluminator uv dan thermocyler (PCR machine) serta dapat mengoperasikan alat-alat tersebut dengan benar.

METODELOGI

Waktu dan Tempat

            Praktikum ini dilakukan pada hari Senin taggal 26 September 2016 pukul 08.00 – 10.30 WIB. Praktikum ini dilakukan di laboraturium Fisiologi dan Biologi Molekular Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah mikropipet, sentrifuga, spektrofotometer uv-vis, elektroforesis, transiluminator uv, dan thermocycler. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah alat tulis.

Cara Kerja

Mikropipet

            Pipet tip yang steril dipasangkan pada ujung pipet, sebelum ujung tip dimasukkan ke larutan, tombol injector ditekan sampai pada batas berhenti pertama. Kemudian ujung tip dimasukkan ke dalam larutan kurang lebih 3 mm. Secara perlahan tombol injektor dilepas kembali pada posisi bebas, sampai larutan terisap ke dalam tip. Kemudian, pipet diangkat secara perlahan dari larutan, sehingga tidak ada tetesan larutan yang tertinggal pada ujung tip. Ujung tip diposisikan pada dinding tabung atau tempat dimana larutan akan dimasukkan dan diusahakan dinding tabung pada posisi miring. Kemudian secara perlahan tombol injektor ditekan sampai pada batas berhenti pertama, dan hentikan, setelah itu ditekan kembali sampai batas berhenti kedua. Setelah itu tip diangkat dari tabung secara perlahan. Selanjutnya, posisi tombol injektor dikembalikan pada posisi bebas dan tip dilepaskan dari ujung mikropipet. Terakhir, volume mikropipet diatur pada volume maksimal jika tidak digunakan dan diposisikan tegak pada rak mikropipet.

Sentrifuga

            Sentrifuga disambungkan dengan sumber listrik, kemudian dinyalakan dengan menekan tombol ON, tutup sentrifuga dibuka dengan menekan tombol open lid . kemudian tabung yang berisi sampel pada rotor alat sentrifuga disusun pada posisi yang seimbang. Selanjutnya, sentrifuga ditutup dengan rapat, kemudian diatur tombol kecepatan putaran yang diinginkan, tombol waktu, dan pengaturan suhu. Setelah diatur, kemudian ditekan tombol start dan alat dibiarkan bekerja. Setelah alat sentrifuga selesai, secara otomatis alat akan berhenti dan tutup tidak boleh dibuka sebelum rotor benar-benar berhenti. Terakhir, tabung dikeluarkan dan sentrifuga ditutup kembali.

Spektrofotometr uv-vis

            Alat disambungkan dengan sumber listrik, kemudian dinyalakan dengan menekan tombol ON. Alat dibiarkan untuk melakukan warming up selama kurang lebih 15 menit atau tergantung jenis alatnya. Kemudian larutan blanko dalam kuvet disiapkan, selanjutnya program untuk mengatur konsentrasi dan kemurnian DNA/RNA diatur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemudian kuvet yang berisi sampel dimasukkan, dan dibiarkan nilai absorbansi sampel terbaca oleh alat. Jika pengukuran selesai, program dikembalikan ke menu awal. Terakhir alat dimatikan juka tidak digunakan.

Elektroforesis Horizontal

            Gel agarosa disiapkan kemudian dipasangkan pada tangki elektroforesis dengan posisi sumuran dekat dengan elektroda negatif. Tangki diisi dengan running buffer 1x, dapat berupa buffer TAE 1x atau TBE 1x hingga gel agarosa terendam. DNA ladder serta sampel DNA yang telah dicampur dengan loading dye dimasukkan  pada sumuran, dilakukan dengan hati-hati jangan sampai gel agarosa bocor. Selanjutnya tangki elektroforesis ditutup, kemudian disambungkan dengan power supply, dan diatur dengan teganggan 100 volt, arus 400 mA, dan waktu running 45 menit atau sesuai keperluan. Kemudian dibiarkan proses elektroforesis berjalan. Jika telah selesai, power supply dimatikan dan tutup tangki dilepas. Selanjutnya gel agarosa dikeluarkan, kemudian DNA dapat divisualisasikan di bawah sinar uv dengan transiluminator uv. Terakhir tangki dibersihkan, dibilas dengan aquades, dan dikeringkan dengan tisu.

Transiluminator uv

            Pertama-tama disambungkan dengan sumber listrik kemudian dinyalakan dengan menekan tombol ON. Tutup transiluminator uv dibuka, selanjutnya digunakan sarung tangan karet untuk mengatur posisi gel agarosa diatas transiluminator uv dan ditutup kembali penutup anti sinar uv. Digunakan kaca mata pelindung anti sinar uv, jika perlu digunakan helm pelindung anti uv. Selanjutnya dinyalakan saklar lampu. Pita DNA diamati kemudian didokumentasikan dengan kamera. Jika sudah selesailampu uv dimatikan dan alat dimatikan. Terakhir gel agarosa dikeluarkan dan dibersihkan dengan tisu basah.

Thermocycler

            Alat disambungkan dengan sumber listrik kemudian dinyalakan dengan menekan tombol ON. Alat dibiarkan melakukan warming up selama kurang lebih 15 menit. Program untuk membuat protocol PCR baru diatur atau protocol yang telah tersedia. Volume reaksi yang digunakan diatur, selanjutnya dibuka penutup thermocycle dan disusun posisi tabung PCR, dan ditutup kembali thermocycle dengan hati-hati. Tombol start ditekan untuk menjalankan PCR, dan alat dibiarkan bekerja. Jika telah selesai, tabung PCR dikeluarkan dan disimpan pada suhu 4⁰C. Tampilan menu awal diatur kembali dan biarkan alat mencapai suhu ruang lalu dimatikan.

HASIL

Berdasarkan pada hasil praktikum, maka diperoleh data yang tertera pada tabel berikut :

                                    Tabel 1. Alat-Alat Analisis Biologi Molekular

No.	Nama Alat	Fungsi	Prinsip Kerja	Gambar
1.	Mikropipet	Mengambil cairan dalam satuan mikroliter (mL)	Tekanan Thumb Knob, pada hambatan pertama (first stop) membuat larutan di luar terhisap dan masuk ke dalam tip. Tekanan kedua (second stop) membuat larutan yang berada di dalam tip keluar. Thumb Knob yang diputar searah jarum jam dan dibantu sedikit penekanan akan mendorong tip keluar dari mikropipet, sehingga tip akan terlepas.	(Sumber: Dok. Pribadi, 2016)
2.	Sentrifuga	Fraksinasi beberapa komponen berdasarkan berat molekulnya	Memanfaatkan gaya sentrifugal, yaitu gaya yang timbul akibat benda yang diputar dari satu titik sebagai porosnya untuk memisahkan partikel dari satu benda cair atau memisahkan benda cair dari kepadatan yang berbeda . Kecepatan rotor 0-3.000 rpm, menampung 5-100 ml sampel	(Sumber: Internet, 2016)
3.	Refrigerated Microsentrifuge	Fraksinasi beberapa komponen berdasarkan berat molekul dan dilengkapi sistem pendingin untuk menjaga sampel agar tetap dingin	Memanfaatkan gaya sentrifugal, rotor berkecepatan tinggi (0-20.000 rpm), untuk volume microtube berkisar 0,5 – 2 ml, dan menggunakan suhu yang rendah	Sumber: Dok. Pribadi, 2016)
4.	Tabung Mikro (Blue Tube Volume 15 mL)	Sebagai wadah sampel/cairan	Memanfaatkan putaran rotor dari sentrifuga	(Sumber: Dok. Pribadi, 2016)
5.	Tabung Mikro (Microtube) Volume 5 mL	Sebagai wadah sampel/cairan	Memanfaatkan putaran rotor dari mikro sentrifuga	(Sumber: Dok. Pribadi, 2016)
6.	Spektrofotometer uv-vis	Mengukur nilai absorbansi larutan	Memanfaatkan kisaran panjang gelombang dan cahaya tampak. Cahaya diteruskan àDibaca dan dikonversi oleh detektor à muncul nilai atau angka pada reader	(Sumber: Dok. Pribadi, 2016)
7.	Kuvet	Wadah larutan blanko dan sampel	Memanfaatkan penyerapan sinar ultra violet Sinar uv àditeruskan menembus cuvet à terbaca oleh detektor	(Sumber: Dok. Pribadi, 2016)
8.	Elektroforesis horizontal	Memvisualisasikan protein atau materi genetik	Migrasi partikel bermuatan di bawah pengaruh arus listrik	(Sumber :Dok.Pribadi, 2016)
9.	Transiluminator UV	Memvisualisasikan hasil pergerakan DNA/RNA pada gel hasil elektroforesis dengan menggunakan sinar UV	Visualisasi atau pengamatan pita DNA yang tampak melalui bantuan sinar ultraviolet	(Sumber : Dok. Pribadi, 2016)
10.	Thermocycler (PCR machine)	Menjalankan proses amplifikasi DNA	Amplifikasi atau perbanyakan nukleotida melalui proses enzimatik yang dilakukan secara in vitro	(Sumber : Dok.Pribadi, 2016)

PEMBAHASAN

            Pengenalan alat-alat analisis molekular sangat penting agar dapat memahami prinsip kerja dari alat-alat yang digunakan terkait dalam melakukan praktikum dan menganalisis  data-data molekular. (Mayangsari, 2012).

            Mikropipet merupakan alat yang berfungsi untuk memindahkan cairan dalam jumlah kecil secara akurat. Sedangkan jenis pipet lainnya, seperti pipet ukur dan pipet gondok tidak mempunyai akurasi yang tinggi untuk volume cairan kurang dari 1 ml. Mikropipet yang digunakan dalam praktikum biologi molekular adalah mikropipet single channel, yaitu mikropipet yang hanya dapat menghisap satu jenis cairan dalam satu kali isapan.  Mikropipet dilengkapi dengan tip berbagai ukuran yang disesuaikan dengan jenis mikropipet. Tip biru (Blue tip), digunakan untuk mengambil cairan dengan kisaran volume 100-1000 ml. Tip kuning (Yellow tip), memiliki kisaran volume 10-200 ml, dan tip putih (White tip), memiliki kisaran volume 0,2-10 ml. (Khopkar,1990).

Prinsip kerja dari mikropipet ini adalah tekanan dari Thumb Knob. Tekanan Thumb Knob pada hambatan pertama (first stop) membuat larutan di luar terhisap dan masuk ke dalam tip. Tekanan kedua (second stop) membuat larutan yang berada di dalam tip keluar. Thumb Knob yang diputar searah jarum jam dan dibantu sedikit penekanan akan mendorong tip keluar dari mikropipet, sehingga tip akan terlepas. Hal ini dikarenakan gaya dorong (gaya tekan) di dalam tip lebih besar dibandingkan di luar tip. Selain itu, perbedaan pengambilan larutan dengan Thumb Knob juga disepengaruhi oleh tingkat viskositas (kekentalan) dari suatu larutan (Mahardika, 2005).

Sentrifuga dapat mengendapkan partikel-pertikel dalam sebuah larutan. Alat ini sering digunakan dalam fraksinasi beberapa komponen berdasarkan berat molekulnya. Alat ini juga dilengkapi oleh tabung sentrifuga dengan beberapa variasi ukuran, antara lain tabung mikro 1,5 ml, 15 ml, 50 ml, dan sebagainya. Kecepatan putaran rotor sentrifuga dinyatakan dalam satuan revolution per minute (x g) atau relative centrifugal force (rcf). Semakin besar kekuatan sentrifugalnya maka pengendapannya menjadi semakin cepat dan efektif. Terjadinya pengendapan bergantung pada kecepatan dari jari-jari dan sentrifugatornya. Kemudian, terdapat dua tipe baling-baling  sentrifuga, yaitu fixed-angle dan swing out. Pemisahan partikel pada tipe fixed-angle terjadi lebih cepat karena kekuatan sentrifugal yang besar dibandingkan tipe baling-baling swing out. Tipe baling-baling swing out memiliki tabung yang berukuran panjang. Pada saat penggunaannya, panjang tabung tersebut tidak boleh melebihi panjang jari-jari sentrifugator karena dapat terjadi kerusakan saat alat dinyalakan (Cheesbrough, 2005).

Spektrofotometer uv-vis berfungsi untuk mengukur nilai absorbansi suatu larutan pada kisaran panjang gelombang sinar ultra violet dan cahaya tampak. Prinsip kerjanya, yakni apabila cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh pada suatu medium homogen maka sebagian dari sinar yang masuk akan dipantulkan, sebagian diserap dalam medium itu, dan sisanya akan diteruskan. Detektor atau pembaca cahaya dari sampel akan mengkonversi data sinar menjadi nilai atau angka yang akan ditampilkan pada reader (Triyati, 1995).

Adapun nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel. Untuk mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA panjang gelombang yang dibituhkan adalah 260 nm dan 280 nm, sehingga alat ini disebut juga sebagai DNA/ RNA kalkulator. Saat menutup tempat kuvet, hindarkan dari adanya cahaya yang masuk ke dalam alat karena apabila ada cahaya lain maka secara otomatis jumlah cahaya yang diukur menjadi bertambah. Alat ini dilengkapi dengan dua lampu dengan panjang gelombang berbeda, yakni lampu Wolfram untuk sinar visible (380- 780 nm) dan lampu deuteium untuk sinar ultra violet (180-380 nm). Spektrofotometer uv-vis juga dilengkapi dengan kuvet berbagai ukuran sebagai wadah larutan blanko dan sampel (Triyati, 1995).

                Kuvet berfungsi sebagai tempat larutan yang diukur absorbansi atau transmitannya. Kuvet yang digunakan pada daeah ultraviolet menggunakan kuvet yang terbuat dari kuarsa atau kaca silika, sedangkan daerah tampak terbuat dari kaca. Pada umumnya tebal kuvet adalah 10 mm, tetapi juga ada ukuran yang lebih kecil dan lebih besar yang dapat digunakan. Kuvet yang biasa digunakan berbentuk persegi, tetapi ada juga yang berbentuk silinder (Mayangsari, 2012).

Kemudian, alat selanjutnya ialah elektroforesis yang merupakan suatu teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Alat ini menggunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut (Mayangsari, 2012).

Asam nukleat laju migrasinya berbanding terbalik dengan ukuran molekulnya. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif. Semakin besar ukuran molekulnya, semakin rendah  laju  migrasinya. Semakin tinggi konsentrasi media semakin lambat kecepatan DNA, sedangkan jika arus dinaikan maka semakin cepat pergerakan DNA (John, 2011).

Transiluminator UV adalah alat yang digunakan untuk memvisualisasikan DNA setelah proses elektroforesis. Alat ini umum dalam laboratorium yang bekerja dengan aspek biologi molekular. Prinsip kerja transilumnator UV adalah sinar UV dipancarkan dan akan memendarkan Ethidium bromide (EtBr) yang membuat khelat dengan molekul DNA, sehingga DNA dapat dilihat oleh mata manusia (Yuwono, 2006).

Alat molekular selanjutnya adalah thermocycler yang merupakan alat yang berfungsi untuk menjalankan proses amplifikasi DNA atau Polymerase Chain Reaction (PCR). Amplifikasi DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang disebut amplimers. Primer DNA suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA. PCR memungkinkan akan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Umumnya primer yang digunakan pada PCR terdiri dari 20-30 nukleotida. DNA template (cetakan) yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan dan berasal dari patogen yang terdapat dalam spesimen klinik. Enzim DNA polimerase merupakan enzim termostabil Taq dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) menempel pada ujung 3’ primer ketika proses pemanjangan dan ion magnesium menstimulasi aktivasi polymerase (Yuwono, 2006).

            Pada proses PCR menggunakan menggunakan alat termosiklus. Sebuah mesin yang memiliki kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan mengatur temperatur untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat, yaitu denaturasi, annealing, dan extension (Mordechai, 1999).

            Denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5˚C (Mordechai, 1999).

Saat proses annealing (penempelan), pengenalan (annealing) suatu primer terhadap DNA target tergantung pada panjang untai, banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu sendiri. Optimalisasi pada temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting Temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA template. Pada umumnya temperatur annealing biasanya 5ºC ddibawah Tm primer yang sebenarnya. Secara praktis, Tm ini dipengaruhi oleh komponen buffer, konsentrasi primer dan DNA template (Mordechai, 1999).

Kemudian tahapan berlanjut ke proses extension. Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72˚C diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda. Reaksi-reaksi tersebut di atas diulangi lagi dari 25 – 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. (Mordechai, 1999).

Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi. Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Metode ini terdiri atas menginjeksi DNA ke dalam gel agarosa dan menyatukan gel tersebut dengan listrik. Hasilnya untai DNA kecil pindah dengan cepat dan untai yang besar diantara gel menunjukkan hasil positif. (Khopkar, 1990).

Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Spesifitas PCR terletak pada kemampuannya mengamplifikasi sehingga menghasilkan produk melalui sejumlah siklus. Keakuratan yang tinggi karena DNA polymerase mampu menghindari kesalahan pada amplifikasi produk.

KESIMPULAN

Alat-alat praktikum biologi molekular adalah mikropipet, sentrifugasi, spektrofotometer uv-vis (DNA/RNA calculator), elektroforesis horisontal, elektroforesis vertikal, transluminator uv dan thermocyler (PCR machine). Alat-alat tersebut merupakan alat utama yang digunakan dalam bidang molekular. Alat-alat laboratorium mempunyai cara dan prinsip kerja yang berbeda-beda. Selain itu juga dapat meminimalisir resiko kesalahan kerja pada saat melakukan praktikum biologi molekular. Setiap pengguna harus mengikuti hal-hal tersebut agar dalam menggunakan alat-alat laboratorium tidak terjadi kerusakan alat ataupun hal-hal yang berbahaya (Mordechai, 1999).

SARAN

Saat melakukan suatu kegiatan yang berhubungan dengan molekular khususnya dalam praktikum biologi molekular, praktikan harus sangat memperhatikan alat-alat apa yang harus dipakai untuk melakukan suatu kegiatan karena alat-alat tersebut memiliki prinsip kerja dan fungsi yang berbeda-beda, begitu pula dalam hal pemeliharaan (maintenance) alat-alat tersebut. 

DAFTAR PUSTAKA

Cheesbrough, Monica. 2005. District

Laboratory Parctice in Tropical

Countries,ed.Vol.2.Cambridge.

Cambridge University Press

John dan Rachmawati. 2011. Chemistry

3A Universitas. Erlangga.

Jakarta

Khopkar, S. M. 1990. Konsep Dasar

Kimia Analitik. UI-Press. Jakarta

Mahardika, I.G. Ngurah K. 2005.

Polymerase Chain Reaction. Jurnal Veteriner Vol.4 No. 1. Bali.

Mayangsari, Yunika. 2012.

Electrophoresis.Fakultas

Teknologi Agrikultural UGM:

Yogyakarta

Mordechai, E., 1999. Application of PCR

The methodologies in Molecular Diagnostic. Burlington Country, USA.

Triyati, Etty. 1995. Spektrofotometer

Ultra-Violet dan Sinar Tampak

Serta Aplikasinya dalam Oseanologi. Oseana. Vol. 10. No 1: 39-7. Universitas Airlangga

Yuwono dan Tribowo, 2006. Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction, Panduan Eksperimen PCR untuk Memecahkan Masalah Biologi Terkini, Penerbit Andi, Yogyakarta.